昆明小鼠放射性肺炎病理觀察

楊 鈐 馮瑪莉 朱麗娜 仝立國(guó)

(山西省中醫(yī)藥研究院臨床藥理研究室，太原 030002)

放射性肺損傷是胸部腫瘤放療、骨髓移植等預(yù)處理后常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)加速患者死亡[1]。病程可分為早期急性肺炎和晚期放射性肺纖維化2期[2]。本研究模擬臨床放療條件，制備昆明小鼠放射性肺炎模型，闡明疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程肺部病理變化，為中藥治療奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本(對(duì)象)選擇及分組

昆明小鼠，雌雄各半，5周齡，體質(zhì)量為(20±2)g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：[SCXK(京)2014-0004]。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：同時(shí)分籠飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室，自然光照，自由進(jìn)水，室內(nèi)溫度18～29 ℃，濕度36%～60%。

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組以及模型組照射后7th、14th、28th 3組。每組10只，雌雄各半。

1.2 模型制備

動(dòng)物經(jīng)3%戊巴比妥麻醉后，采用6MV的X射線20Gy單次全胸照射(圖1)造模，照射位置為頭部下方、劍突以上，照射野面積2 cm×3 cm，劑量率：2 Gy/min，放射源距皮100 cm?？瞻捉M不做任何處理。

圖1 6MV的X射線20Gy單次全胸照射， 放射源距皮100 cmFig.1 20 Gy cumulative dose of 6MV X-ray irradiation of full chest once, and source-skin distance=100 cm

1.3 取材及常規(guī)病理觀察

分別于照射后第7、14、28天后殺檢取材，肺臟經(jīng)宏觀觀察后，與心臟一起包入紗布中置于10%中性甲醛溶液進(jìn)行固定。取左肺葉和右肺中葉，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，經(jīng)HE染色后顯微鏡下觀察肺臟組織病理學(xué)形態(tài)改變。

1.4 HE染色步驟

二甲苯I-1 10 min→二甲苯I-2 10 min→二甲苯I-3 10 min→無(wú)水乙醇I 5 min→95%乙醇 I 5 min→75%乙醇I 5 min→蘇木素 4 min→自來(lái)水清洗→0.5%鹽酸 5 s→自來(lái)水清洗→1%氨水 5 s→自來(lái)水清洗→伊紅 2 min→75%乙醇II 5 s→85%乙醇 5 s→95%乙醇II 5 s→無(wú)水乙醇II 10 min→二甲苯II-1 10 min→二甲苯II-2 10 min→二甲苯II-3 10 min[3]。

1.5 圖像分析

采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)組織切片中肺泡壁厚度、肺泡腔面密度(肺泡腔面積/視野單位面積)、肺間質(zhì)面密度(肺間質(zhì)面積/視野單位面積)[4]。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野測(cè)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 照射后KM小鼠臨床表現(xiàn)

照射3 d后，KM小鼠背部胸段照射野被毛脫落，狀態(tài)萎靡。

2.2 組織病理學(xué)形態(tài)變化

空白對(duì)照組肺實(shí)質(zhì)與間質(zhì)部分病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)均正常(圖2-A)。模型組照射7 d后可見(jiàn)輕度肺炎，肺泡間隔增寬、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2-B)。照射14 d后表現(xiàn)為輕-中度肺炎，肺泡塌陷，炎細(xì)胞浸潤(rùn)肺泡間隔，破壞肺泡結(jié)構(gòu)，輕度滲出(圖2-C)。照射4周后可見(jiàn)重度肺炎，肺泡塌陷實(shí)變，炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)，輕度纖維化改變，毛細(xì)血管充血，氣管支氣管上皮雜亂、脫落(圖2-D)。

圖2 組織病理學(xué)形態(tài)變化 HE ×100注：A： 空白對(duì)照組；B： 20Gy照射后7 d；C： 20Gy照射后14 d；D： 20Gy照射后4周Fig.2 Lung histopathological changes HE×100Note:A: Blank control group; B: 7 d after 20Gy irradiation; C: 14 d after 20Gy irradiation; D: 4 weeks after 20Gy irradiation

2.3 定量測(cè)定

正常對(duì)照組與模型組肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺間質(zhì)面密度變化見(jiàn)表1。照射20Gy后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，肺泡壁增厚，第7、14、28天測(cè)量結(jié)果差異顯著(P<0.01)；肺泡腔萎縮，面積減小，第7天后差異顯著(P<0.05)，第14、28天后差異極顯著(P<0.01)；肺間質(zhì)增寬，面積增大，第14、28天后測(cè)量差異極顯著(P<0.01)。

表1 肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺間質(zhì)面密度測(cè)量結(jié)果Table 1 The determination of thickness of alveolar walls and surface mass density of alveolar spaces and interstitial tissue

注：*P<0.05；**P<0.01

Note：*P<0.05 vs control,**P<0.01 vs control

3 討論

放射性肺炎系由肺癌、食管癌、乳腺癌或胸部其他惡性腫瘤經(jīng)放射治療后,在放射野內(nèi)的正常肺組織受到損傷而引起的炎癥反應(yīng)，該病的發(fā)生率為5%～50%，嚴(yán)重肺炎發(fā)生率為10%～20%，病死率高達(dá)50%[5]。盡管近年來(lái)治療手段不斷進(jìn)步,尤其是中醫(yī)辨證治療放射性肺炎具有較好的療效[6]，但是該病的發(fā)生率仍高達(dá)30%。放射性肺炎的發(fā)生發(fā)展對(duì)機(jī)制研究及防治措施的優(yōu)化至關(guān)重要，綜合遺傳背景、研究費(fèi)用及操作難易程度等因素，選擇昆明種小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[7-8]。模擬臨床放療條件建立放射性肺炎模型，闡明放射性肺炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程的病理變化。

參照周仟等、白蘊(yùn)紅等[9-10]方法，采用6MV的X線單次大劑量20Gy照射復(fù)制小鼠放射性肺損傷模型，分別于照射后第7、14、28天，觀察小鼠一般體征，并進(jìn)行病理HE染色觀察。射線照射3 d后出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、體質(zhì)量減輕、胸背部脫毛等狀況。此外，隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，肺泡，肺間質(zhì)均出現(xiàn)進(jìn)行性病變，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6MV的X線20Gy輻照對(duì)肺部病變有明顯影響。昆明小鼠輻照第7天后，肺間質(zhì)增寬，炎細(xì)胞輕度浸潤(rùn)；輻照第14天后，肺泡塌陷，肺間質(zhì)進(jìn)一步增厚，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，紅細(xì)胞輕度滲出，表明肺部病變已初步出現(xiàn)；而輻照第28天后，肺泡萎縮實(shí)變，炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血，氣管支氣管上皮雜亂、脫落，出現(xiàn)輕度纖維化改變，表明肺部病變已經(jīng)非常明顯。此外，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)定量分析結(jié)果，顯示輻照第14、28天后肺泡壁厚度、肺泡腔面積、肺間質(zhì)面積變化極顯著(P<0.01)。本次實(shí)驗(yàn)主要偏向于從宏觀、表觀方向選擇表征放射性肺炎病變的關(guān)鍵指標(biāo)，如肺泡壁厚度、肺泡腔面積、肺間質(zhì)面積等進(jìn)行觀察描述，下一步應(yīng)從分子生物學(xué)角度對(duì)放射性肺炎的病理機(jī)理予以進(jìn)一步觀察和驗(yàn)證。綜上所述，病理學(xué)研究結(jié)果符合放射性肺炎的病變規(guī)律[8]，可用于進(jìn)一步藥理研究。