重組人干擾素內(nèi)皮抑制肽融合蛋白抗腫瘤藥效的研究

劉賀煜 王 瑩 劉錦輝 姜媛媛 黃 炎 李會(huì)成

(1. 哈藥集團(tuán)生物工程有限公司,哈爾濱 150020)(2. 哈藥集團(tuán)技術(shù)中心，哈爾濱 150020)

腫瘤新生血管可為不斷浸潤(rùn)生長(zhǎng)的原發(fā)腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)，它們?cè)谀[瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要的促進(jìn)作用。IFN具有抗腫瘤血管生成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[1]。

內(nèi)皮抑素是由膠原蛋白XIII羧基末端的184個(gè)氨基酸組成的一種內(nèi)源性血管生成抑素，于1997年由O’Reilly等發(fā)現(xiàn)。它能特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的生成，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)所使用的30肽，是一種具有30個(gè)氨基酸的內(nèi)皮抑素。已有研究證實(shí)，內(nèi)皮抑素活性區(qū)主要在N端的1～27個(gè)氨基酸上[3]。而30肽是一種人工合成的人內(nèi)皮抑素,它保留內(nèi)皮抑素的活性，而分子量大大減少。

重組人干擾素內(nèi)皮抑制肽融合蛋白(以下簡(jiǎn)稱(chēng)I30)，是由干擾素(Interferon，IFN)和重組人內(nèi)皮抑素(以下簡(jiǎn)稱(chēng)30肽)組成的一種融合蛋白。干擾素和30肽在抗腫瘤方面有著相近似的作用機(jī)理，將它們制成融合蛋白，有著協(xié)調(diào)作用，增強(qiáng)抗腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼育環(huán)境

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：NIH小鼠體質(zhì)量18～22 g，雌性，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2015-0001]。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所為本公司(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司)實(shí)驗(yàn)室[SYXK(黑)2015-008]。60Co滅菌全價(jià)顆粒飼料，購(gòu)于北京科澳協(xié)力飼料有限公司[SCXK(京)2014-0010]，飲用水為滅菌水，自由采食和飲水。

1.2 試劑與材料

腫瘤瘤株：H22瘤株由本公司(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

干擾素IFN(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司生產(chǎn))，干擾素30肽融合蛋白(I30)(哈藥集團(tuán)技術(shù)中心基因工程實(shí)驗(yàn)室制備)，30肽(哈藥集團(tuán)技術(shù)中心基因工程實(shí)驗(yàn)室制備)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1荷瘤小鼠模型制作：取4只小鼠腹腔注射H22瘤株，1周后處死所有小鼠，取腹水。

另取40只小鼠，腋下注射腹水0.2 mL/只，細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。

1.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥：參考《細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物非臨床評(píng)價(jià)的技術(shù)指導(dǎo)原則》等[4-10]的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，接種后4 h開(kāi)始給藥。將腋下注射小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：IFN組，皮下注射干擾素9×105IU/只；I30高劑量組，皮下注射I30 80 μg/只；I30低劑量組，皮下注射I30 30 μg/只；陰性對(duì)照組，皮下注射等體積生理鹽水。連續(xù)給藥16 d。

1.3.3小鼠腫瘤質(zhì)量測(cè)定：停藥后2 h，處死所有動(dòng)物，取下瘤塊稱(chēng)重。

1.4 抑瘤率(%)計(jì)算

參考《細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物非臨床評(píng)價(jià)的技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]設(shè)計(jì)計(jì)算公式。抑瘤率公式：抑瘤率=(1-T/C)×100%。(T：治療組；C：陰性對(duì)照組)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

對(duì)照組小鼠平均瘤重為1.605 g，大于1 g，表明本次實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長(zhǎng)良好[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明I30高劑量組和低劑量組抑瘤率均高于40%[4]，且其效果優(yōu)于干擾素。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有小鼠雖體型消瘦，但精神狀態(tài)良好，飲食飲水正常。提示該融合蛋白具有抗腫瘤作用,見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量Table 1 Tumor weight of mice in each group

注：*表示與對(duì)照組比較，*P<0.05

Note:*indicate compared with the control group,*P<0.05

3 討論

腫瘤一直是醫(yī)學(xué)治療的難題。目前已有多個(gè)通過(guò)抑制血管生成的抗腫瘤藥物上市，如世界上首個(gè)上市的恩度，在臨床上獲得了不錯(cuò)的療效。腫瘤的產(chǎn)生同時(shí)伴著新生血管的生成，腫瘤需要腫瘤血管為其提供營(yíng)養(yǎng)成分和運(yùn)輸代謝物。腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移同樣需要腫瘤血管。抑制了腫瘤血管的生成，將會(huì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)與擴(kuò)散。目前關(guān)于內(nèi)皮抑素的作用機(jī)制尚未完全定論。根據(jù)已有的研究結(jié)果表明，內(nèi)皮抑素與整合素α5β1的結(jié)合在其活性機(jī)制中有著重要作用。內(nèi)皮抑素通過(guò)其N(xiāo)末端與整合素α5β1結(jié)合，抑制bFGF誘導(dǎo)的FAK/c-Raf/NAKl/2/p38/ERKl絲裂活化蛋白激酶途徑，從而發(fā)揮其活性作用[2]。將內(nèi)皮抑素N-端的27 個(gè)氨基酸核心序列，引入串聯(lián)的RGD 短肽，構(gòu)成的新的肽鏈，命名為人血管內(nèi)皮抑制肽。該肽在保持內(nèi)皮抑素原有的抑制血管生成活性同時(shí)，由RGD 序列賦予其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的活性，可增強(qiáng)其抗腫瘤效果，而且氨基酸序列較內(nèi)皮抑素更為簡(jiǎn)單[13]。而在成年人的身體中，幾乎不會(huì)有新生血管生成，抑制血管生成的藥物因此不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用，其安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物。抑制血管生成的藥物藥效好，副作用小，是未來(lái)抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)重要的課題。

干擾素α雖然被廣泛用于抗病毒，但美國(guó)FDA最早批準(zhǔn)干擾素α的適應(yīng)癥卻是毛細(xì)胞白血病(毛細(xì)胞白血病是一種淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，由于此種白血病細(xì)胞在顯微鏡下，尤其在電子顯微鏡下其胞漿有明顯的毛狀突起，故稱(chēng)為毛細(xì)胞，因而命名為毛細(xì)胞白血病。廣義上仍為一種特殊類(lèi)型的慢性淋巴細(xì)胞白血病。毛細(xì)胞白血病主要見(jiàn)于老年男性，男女比例為4∶1)。研究表明，干擾素抗腫瘤作用機(jī)理中抑制腫瘤血管生成和30肽抗腫瘤的作用機(jī)理接近。IFN可抑制VEGF、b-FGF、MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)的表達(dá)，是其抗血管生成的重要機(jī)制之一。IFN能夠降低VEGF、b-FGF等血管形成因子的產(chǎn)生，減少腫瘤新生血管形成[14]。

細(xì)胞因子可以介導(dǎo)機(jī)體多種免疫反應(yīng)，如腫瘤免疫、感染免疫、移植免疫、自身免疫及造血系統(tǒng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞因子的作用具有多相性、網(wǎng)絡(luò)性的特點(diǎn)，它們不僅可以單獨(dú)地發(fā)揮生物學(xué)活性，而且不同的細(xì)胞因子之間還有相互協(xié)調(diào)和相互制約的作用，利用細(xì)胞因子的這一特點(diǎn)，人們可以根據(jù)自己的設(shè)想，通過(guò)基因融合等技術(shù)創(chuàng)造出自然界原本不存在的活性更佳的細(xì)胞因子融合蛋白[16]。目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了不少融合蛋白類(lèi)藥物上市。如Enbrel(依那西普/etanercept)，在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已取得了很不錯(cuò)的臨床效果。隨著基因工程技術(shù)的成熟與應(yīng)用，兩個(gè)甚至多個(gè)不同基因之間很容易做到相互串聯(lián)或彼此鑲嵌，形成嵌合基因，一旦表達(dá)成產(chǎn)物則獲得融合蛋白[15]。

本次試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，給藥組和陰性對(duì)照組小鼠，均是體型消瘦，但狀態(tài)良好，提示了I30的毒性較小。I30的作用為抑制血管生成。在成年人的身體中，幾乎不會(huì)有新生血管生成，抑制血管生成的藥物因此不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用。

本次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有采用裸鼠接種人源瘤株的方法。是因?yàn)楸菊n題還處于前期研究的階段，并沒(méi)有進(jìn)入到通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選抗腫瘤譜的階段。在后續(xù)研究中，采用通過(guò)把患者的腫瘤轉(zhuǎn)移到免疫缺陷小鼠獲得人源性腫瘤異種移植(PDX)的小鼠模型[12]來(lái)進(jìn)行篩選。

在接種瘤株后，并沒(méi)有采用等小鼠腫瘤生長(zhǎng)到一定程度后再給藥的方式。因?yàn)樾∈蟾伟〩22細(xì)胞是一種鼠源的惡性腫瘤，在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)極快。和接種人源瘤株不同，H22幾乎均能成功生長(zhǎng)。本次試驗(yàn)陰性對(duì)照組平均瘤重(1.605±0.415) g，也表明腫瘤生長(zhǎng)良好。即便是細(xì)胞毒類(lèi)藥物也無(wú)法抑制腫瘤最后階段的生長(zhǎng)，此時(shí)已無(wú)法對(duì)供試品進(jìn)行評(píng)價(jià)。所以需在腫瘤長(zhǎng)至無(wú)法抑制之前，終止試驗(yàn)。鼠源瘤株大多會(huì)選擇陰性對(duì)照組瘤重為1 g時(shí)做為試驗(yàn)終至?xí)r間[11]。而H22在5～8 d即可長(zhǎng)到1 g。如果采用腫瘤體積達(dá)到100～300 mm3后再給藥，會(huì)導(dǎo)致給藥時(shí)間短，有些藥物可能會(huì)因?yàn)榻o藥時(shí)間短而藥效不理想。另一方面也打算將I30用于腫瘤的早期治療，故采用了接種后馬上給藥的方式。

選擇已上市藥物作為陽(yáng)性對(duì)照藥，可以比對(duì)在研藥物和已上市藥物的藥效的差異。為在研藥物市場(chǎng)定位提供數(shù)據(jù)支持，也同時(shí)為將來(lái)的學(xué)術(shù)推廣提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。故本次試驗(yàn)選擇了已上市的干擾素作為陽(yáng)性對(duì)照藥。IFN抑制腫瘤血管生成和30肽抗腫瘤的作用機(jī)理接近，融合蛋白可以形成協(xié)同作用。I30是利用基因工程的方法將干擾素和30肽通過(guò)接頭序列(linker)連接起來(lái)的一種細(xì)胞因子重組融合蛋白，不僅可以提高兩者的治療效果。而且降低IFN的使用量，降低使用IFN帶來(lái)的副作用。