不同功率532 nm激光誘導(dǎo)棕色挪威大鼠脈絡(luò)膜 新生血管模型的實(shí)驗(yàn)研究*

孟 梁 梁鳳鳴 王 莉 黎紅梅 張欣桐

(1. 天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300340)(2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300391)

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體，其生成與(或)破裂是導(dǎo)致眼底滲出、出血的關(guān)鍵，也就是直接導(dǎo)致患者視力下降、視物變形、視野缺損的直接原因。因此各種造成脈絡(luò)膜新生血管生成與破裂的相關(guān)疾病，如濕性黃斑變性，中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變，高度近視性視網(wǎng)膜病變等，已成為人群致盲的主要原因之一[1]?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)于激光誘導(dǎo)棕色挪威大鼠(Brown Norway，BN)產(chǎn)生CNV的機(jī)理已達(dá)成共識(shí)。唐坤用532 nm激光，功率160～170 mW,光斑直徑50 μm，曝光時(shí)間0.1 s，圍繞視盤(pán)約2～3個(gè)PD光凝BN大鼠，每眼6～8個(gè)點(diǎn)，證實(shí)532激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV動(dòng)物模型，且CNV模型于21 d達(dá)到成熟[2]。 張舒陽(yáng)等通過(guò)532 nm激光對(duì)BN大鼠造模，在曝光時(shí)間0.1 s，光斑直徑100 μm條件下，功率分別選擇100 mW、200 mW、300 mW，證實(shí)激光功率在300 mW時(shí)CNV成模率最高；CNV形成面積、中央厚度最大，是激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型較為理想的激光功率[3]。任秉儀等通過(guò)532 nm激光對(duì)40只BN大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，每?jī)蓚€(gè)血管弓之間光凝1～2個(gè)激光斑，證實(shí)大鼠造模后1個(gè)激光斑比2個(gè)激光斑的成模率高[4]。通過(guò)532 nm激光造模的實(shí)驗(yàn)研究，存在不同功率的選擇，我們擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討不同功率激光誘導(dǎo)BN脈絡(luò)膜新生血管模型的成功率,旨在選擇合適的激光功率以提高BN大鼠的成模率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性棕色挪威大鼠(BN) 45只,9～11周齡,體質(zhì)量200～250 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，使用許可證號(hào)：SYXK(津)2014-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

鹽酸丙美卡因滴眼液 (商品名愛(ài)爾凱因,S.A.ALCON-COUVREUR N.V.比利時(shí))用以表面麻醉,復(fù)方托吡卡胺滴眼液 (沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司)以散瞳；1%戊巴比妥鈉(上海泰瑞爾生物技術(shù)有限公司)以腹腔麻醉；10%熒光素鈉注射液 (廣西梧州制藥股份有限公司)用于眼底熒光血管造影檢查；眼底彩照造影機(jī)(日本kowa)用于拍攝眼底彩照和熒光素眼底血管造影術(shù)(fluorescein fundus angiography,FFA) 檢查；光學(xué)相干斷層掃描儀(Optical coherence tomography，OCT)(海德堡)以觀(guān)察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)；532 nm綠光激光機(jī) (法國(guó)光太)用以不同功率激光進(jìn)行造模。

1.3 CNV造模及檢查方法

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)了單位倫理委員會(huì)或管理委員會(huì)審批后，對(duì)45只BN大鼠行雙眼檢查，前節(jié)和眼底檢查均未見(jiàn)明顯異常，在實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)1周，后隨機(jī)將其分為3組，每組15只，激光功率依次為400 mW、300 m W、200 m W。進(jìn)行造模前，BN大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(4 mL/kg體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉，均選擇左眼表面麻醉和散瞳后，用不同功率的激光，光斑直徑100 μm，曝光時(shí)間100 ms，每眼光凝10～12個(gè)點(diǎn)，光凝后視網(wǎng)膜以有氣泡產(chǎn)生或輕度出血為準(zhǔn)。

各實(shí)驗(yàn)組大鼠激光造模后的第1周、2周、3周、4周行眼底彩照、熒光素血管造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA) 和光學(xué)相干斷層掃描(Optical Coherence Tomography，OCT)。FFA顯示光斑滲漏則表示造模成功，并對(duì)激光斑滲漏部位進(jìn)行分級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)如下[2]：Ⅰ級(jí)，注射熒光素500～600 s后，眼底未見(jiàn)熒光素滲漏；Ⅱ級(jí)，注射熒光素500～600 s后，眼底存在輕度熒光素滲漏；Ⅲ級(jí)，注射熒光素500～600 s后，眼底存在中度熒光素滲漏；Ⅳ級(jí)，注射熒光素500～600 s后，眼底可見(jiàn)大量熒光素滲漏。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，單向有序資料用秩和檢驗(yàn)，構(gòu)成比用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BN大鼠存活情況

本實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)不同功率的532 nm激光分別對(duì)15只BN進(jìn)行造模研究，從實(shí)驗(yàn)為期4周時(shí)間的存活率來(lái)看，200 mW和300 mW實(shí)驗(yàn)組的BN大鼠均有不同程度的死亡，但是總的存活率維持著80%，而400 mW的實(shí)驗(yàn)組只有46.67%的存活率，考慮與激光功率太大造成大鼠死亡率上升有關(guān)。

表1 不同功率激光同一時(shí)間BN大鼠的存活數(shù)量的組間比較Table 1 Comparison of the survival numbers of BN rats at different power lasers at the same time

2.2 眼底彩照結(jié)果

通過(guò)532 nm激光破壞了正常的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧，誘發(fā)激光斑周?chē)暰W(wǎng)膜水腫，呈灰白色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 不同級(jí)別的熒光滲漏圖注:Ⅰ級(jí):眼底未見(jiàn)熒光素滲漏；Ⅱ級(jí):眼底存在輕度熒光素滲漏;Ⅲ級(jí):眼底存在中度熒光素滲漏;Ⅳ級(jí):眼底可見(jiàn)大量熒光素滲漏Fig.1 Different levels of fluorescence leakageNote:Ⅰdegree:non-fluorescein leakage;Ⅱ degree:a little fluorescein leakage;Ⅲ degree:moderate fluorescein leakage; Ⅳ degree:lager amount of fluorescein leakage

2.3 FFA檢查結(jié)果

FFA檢查前，對(duì)BN大鼠進(jìn)行腹腔及表面麻醉、散瞳，步驟同激光造模，后予以腹腔注射10%的熒光素鈉(0.5 mL/kg)，用眼底彩照造影機(jī)進(jìn)行檢查。

2.3.1同一時(shí)間段的不同功率激光光凝滲漏率的組間比較，結(jié)果如下：

同一時(shí)間段的不同功率激光光凝滲漏率的組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析來(lái)看同一時(shí)間段功率200 mW的與300 mW和400 mW滲漏率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明200 mW的激光能量相對(duì)較小，導(dǎo)致的熒光滲漏率都較低，成模率相對(duì)較低，而300 mW和400 mW相對(duì)比200 mW導(dǎo)致熒光滲漏率較高，成模率較高；功率為300 mW和400 mW在第1、3周時(shí)，其滲漏率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明第1、3周時(shí)，兩組的成模率無(wú)差異，第2、4周對(duì)比滲漏率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第2、4周時(shí)兩組的成模率有差異。而且從光斑數(shù)量可以看出400 mW的功率造模后，光斑大面積融合，甚至導(dǎo)致BN大鼠眼底出血或者后期死亡，所以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中有效數(shù)據(jù)隨著時(shí)間的變化在不斷減少，可能與400 mW的激光能量太大有關(guān)，所以功率為300 mW的激光造模是最佳選擇。

表2 同一時(shí)間段的不同功率激光光凝滲漏率的組間比較Table 2 Comparison between groups of different power laser about fluorescein leakage at the same time period

注：資料為單向有序資料，同一功率組內(nèi)總體比較用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；組內(nèi)兩兩比較用秩和檢驗(yàn)。同一時(shí)間的不同激光功率光凝滲漏率的比較：200和300 mW、200和400 mW比較，aP<0.05；300和400 mW比較,bP<0.05

Note: The data is one-way ordered data. The overall comparison between the same power group is performed by Kruskal-Wallis H test; the two groups are compared by signed-rank test.Comparison between groups of different power laser about fluorescein leakage at the same time period:200/300 mW、200/400 mW，aP<0.05；300/400 mW,bP<0.05

2.3.2同一功率的激光在不同時(shí)間段光凝滲漏率比較，如下：

同一功率的激光在不同時(shí)間段光凝滲漏率的組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，200 mW的激光功率，第1周和第3周、第1周和第4周、第2周和第3周、第2周和第4周比較，其造模的滲漏率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而第1周和第2周、第3周和第4周，其造模的滲漏率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能為第1、2周因?yàn)楣β侍。斐傻难鄣诐B漏率變化不大，于第3周開(kāi)始增加，逐漸到高峰，第4周維持在穩(wěn)定狀態(tài)；功率為300 mW和400 mW的激光功率進(jìn)行造模，除第3周和第4周對(duì)比，其造模的滲漏率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余時(shí)間兩兩對(duì)比，其造模的滲漏率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明隨著時(shí)間的推移，其眼底滲漏率在逐漸增加，第3周到達(dá)高峰并于第4周維持穩(wěn)定，證實(shí)532 nm激光誘導(dǎo)眼底CNV的形成在第3周達(dá)到高峰，并在第4周維持穩(wěn)定狀態(tài)。

表3 同一功率的激光在不同時(shí)間段光凝滲漏率的組內(nèi)比較Table 3 Comparison of fluorescein leakage rates of the same power laser at different time periods

注：資料為單向有序資料，同行×列的卡方檢驗(yàn)。同一功率不同時(shí)間段熒光滲漏率的比較.第1周和第2、3、4周比較，aP<0.05；第2周和第3、4周比較,bP<0.05

Note: The data is one-way ordered data, the two groups are compared by chi-square test.Comparison of fluorescein leakage rates of the same power laser at different time periods:1/2、1/3、1/4，aP<0.05；2/3、2/4,bP<0.05

2.4 OCT檢查結(jié)果

OCT顯示：200 mW的激光光凝后第1、2周OCT檢查見(jiàn)光凝區(qū)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層開(kāi)始斷裂,呈現(xiàn)“凹”字改變；光凝后第3周見(jiàn)光凝區(qū)神經(jīng)上皮層結(jié)構(gòu)層次不清，呈白色高反射,從脈絡(luò)膜突破RPE層進(jìn)入神經(jīng)上皮層，提示CNV已形成；光凝后第4周光凝區(qū)神經(jīng)上皮層呈多層高反射信號(hào)，CNV呈進(jìn)展期。300 mW的激光光凝后第1周OCT檢查見(jiàn)光凝區(qū)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層斷裂,呈現(xiàn)“凹”字改變；光凝后第2周見(jiàn)光凝區(qū)神經(jīng)上皮層較前增厚，結(jié)構(gòu)層次不清，呈白色高反射,從脈絡(luò)膜突破RPE層進(jìn)入神經(jīng)上皮層，提示CNV已形成；光凝后第3周光凝區(qū)神經(jīng)上皮層明顯增厚，呈多層高反射信號(hào)，CNV達(dá)到高峰；光凝后第4周OCT顯示視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與第3周相比無(wú)明顯變化，CNV達(dá)到穩(wěn)定期。400 mW的激光光凝后第1周OCT檢查見(jiàn)光凝區(qū)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層斷裂,部分神經(jīng)上皮層較前增厚，呈白色高反射,光凝后第2、3周前期光凝區(qū)神經(jīng)上皮層明顯增厚，呈多層高反射信號(hào)，CNV達(dá)到高峰，而光凝后第3周后期及第4周部分視網(wǎng)膜已經(jīng)萎縮變薄。從CNV的形成時(shí)間來(lái)看，200 mW組于第4周形成CNV,而300 mW和400 mW組于第3周形成CNV，但是300 mW組的CNV在第4周維持CNV的形態(tài)利于觀(guān)察CNV的形態(tài)，而400 mW組第4周時(shí)神經(jīng)上皮層開(kāi)始萎縮，不利于實(shí)驗(yàn)觀(guān)察，考慮200 mW的能量相對(duì)較小，導(dǎo)致CNV的成模時(shí)間較晚，而400 mW的能量太大，造成了視網(wǎng)膜的損傷，所以還是300 mW的功率適合CNV的造模。任秉儀、Li、Fukuchi、Kim 等的研究結(jié)果也證實(shí)OCT可以觀(guān)察CNV的動(dòng)態(tài)進(jìn)展[4-7]。

3 討論

因?yàn)锽N大鼠的脈絡(luò)膜組織與人的脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)相似，均含有大量的色素細(xì)胞，都可吸收大量光能量，造成視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的損傷，從而誘導(dǎo)CNV的形成。以及BN大鼠取材方便，存活率高，而且成熟周期短，成本較低，因此BN大鼠成為臨床實(shí)驗(yàn)中CNV造模的主要?jiǎng)游飦?lái)源[8-11]。激光光凝可對(duì)老鼠視網(wǎng)膜光凝區(qū)產(chǎn)生熱效應(yīng)、光化學(xué)效應(yīng)及器質(zhì)性損傷效應(yīng)。激光效應(yīng)主要是因?yàn)榧す獾墓饽苣鄣揭暰W(wǎng)膜上，穿破Bruch膜，到達(dá)RPE層及脈絡(luò)膜細(xì)胞層面，周?chē)?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而毛細(xì)血管的管壁通透性增加，血管內(nèi)血漿及血細(xì)胞滲出，導(dǎo)致激光斑周?chē)囊暰W(wǎng)膜缺血缺氧，誘導(dǎo)脈絡(luò)膜滋生新生血管，最終形成CNV。

從FFA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，功率為200 mW激光的造模滲漏率明顯低于300 mW和400 mW，考慮200 mW的功率相對(duì)較小，對(duì)視網(wǎng)膜的損傷相對(duì)較小，所以誘導(dǎo)CNV的成模率較低；而400 mW的功率太大，造成BN大鼠死亡率太高。且從滲漏率可以看出，激光造模的成模率在第3周達(dá)到高峰，隨后維持穩(wěn)定，所以功率為300 mW的激光造模是最佳選擇。張舒陽(yáng)等也通過(guò)532 nm激光，功率分別選擇100 mW、200 mW、300 mW，證實(shí)激光功率在300 mW時(shí)CNV成模率最高，是激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型較為理想的激光功率[3]。

根據(jù)OCT對(duì)CNV的形態(tài)學(xué)觀(guān)察所示，200 mW的激光誘導(dǎo)的CNV于第3周開(kāi)始形成，第4周呈上升趨勢(shì)，逐漸增多，后期達(dá)到穩(wěn)定期；300 mW的激光誘導(dǎo)的CNV于第2周開(kāi)始形成，第3周達(dá)到高峰，第4周趨于穩(wěn)定；400 mW的激光誘導(dǎo)的CNV于第1周后期形成，于第2～3周達(dá)到高峰，3～4周趨于穩(wěn)定，第4周后期部分視網(wǎng)膜因結(jié)構(gòu)破壞而萎縮變薄，這一結(jié)果同F(xiàn)FA觀(guān)察結(jié)果。唐坤、李學(xué)晶及王鑫等通過(guò)532 nm激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV動(dòng)物模型，進(jìn)行切片、染色觀(guān)察組織形態(tài)學(xué)的改變，也證實(shí)了CNV模型于第3周達(dá)到成熟,第4周趨于穩(wěn)定[2，12-13]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察BN大鼠的FFA和OCT的表現(xiàn)圖也得出相關(guān)結(jié)論，而切片和染色相對(duì)FFA和OCT更為復(fù)雜，所以可以通過(guò)觀(guān)察FFA和OCT的形態(tài)學(xué)變化對(duì)造模成果與否進(jìn)行評(píng)估，可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本并增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的可操作性。

綜上所述，波長(zhǎng)532 nm、光斑直徑100 μm、曝光時(shí)間100 ms、每眼光凝10～12個(gè)點(diǎn)，功率為300 mW的激光誘導(dǎo)BN大鼠的成模率最高，且穩(wěn)定性最好，值得進(jìn)一步推廣。