行為箱形狀對(duì)小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響*

杜艷芳 楊 洋 畢田田 畢玉瑩 王 玥 李 婷 白云龍 王宇鑫

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

動(dòng)物的認(rèn)知功能需要通過(guò)對(duì)其學(xué)習(xí)記憶的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此需要建立規(guī)范的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，從而準(zhǔn)確判斷其學(xué)習(xí)記憶的情況。根據(jù)嚙齒類動(dòng)物具有喜歡探索陌生事物的天性[1]，Ennaceur和Delacour[2]于1988年報(bào)道了一種非獎(jiǎng)賞性的、簡(jiǎn)單的認(rèn)知記憶實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀挛矬w與新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物的記憶能力。該模型根據(jù)動(dòng)物對(duì)見(jiàn)過(guò)的熟悉物體和沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的新物體的探究時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)評(píng)價(jià)被測(cè)試動(dòng)物的記憶能力，即當(dāng)被測(cè)試動(dòng)物未遺忘環(huán)境中見(jiàn)過(guò)的熟悉物體時(shí)，便會(huì)用更多的時(shí)間探究沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的新物體；當(dāng)被測(cè)試動(dòng)物遺忘了見(jiàn)過(guò)的熟悉物體，則動(dòng)物對(duì)環(huán)境中沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的新物體和見(jiàn)過(guò)的熟悉物體的探究時(shí)間應(yīng)基本相同。與其它動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法相比，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)具有不需要外部推動(dòng)力，只需要適當(dāng)?shù)挠?xùn)練即可完成，且具有實(shí)驗(yàn)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)[3-4]，受到越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注。但由于新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)缺乏統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，使其應(yīng)用受到一定的限制。以往研究針對(duì)物體材質(zhì)、時(shí)間間隔等具體檢測(cè)條件進(jìn)行[5]，但缺少對(duì)行為箱形狀的研究，為了進(jìn)一步規(guī)范該方法的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究針對(duì)新物體實(shí)驗(yàn)方法中的實(shí)驗(yàn)行為箱形狀對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行考察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

健康ICR小鼠，8周齡，40只，雌雄各半，體質(zhì)量24～26 g，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004]。遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，將小鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，控制溫度在(22±1) ℃，12 h明暗循環(huán)，自由采食和飲水，預(yù)飼期1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

小鼠自主活動(dòng)儀(ZZ-6型，成都泰盟科技有限公司)，動(dòng)物社會(huì)交互行為視頻分析系統(tǒng)(Xeye SI V1.2，北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

ICR小鼠40只隨機(jī)分為2組，每組20只，雌雄各半，即方組(n=20)和圓組(n=20)。各組按性別再次隨機(jī)分為2組，即方雌組(n=10)、方雄組(n=10)、圓雌組(n=10)和圓雄組(n=10)。

1.4 新物體實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前5 d，實(shí)驗(yàn)人員每天將小鼠放到手上撫觸5 min，消除小鼠的緊張恐懼感。實(shí)驗(yàn)前，通過(guò)小鼠自主活動(dòng)儀篩選，剔除活動(dòng)異常的小鼠(活動(dòng)過(guò)少、活動(dòng)過(guò)多、轉(zhuǎn)圈等)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，先將小鼠放到實(shí)驗(yàn)室，讓其適應(yīng)環(huán)境1 h，然后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)包含三個(gè)階段(圖1)。階段1(T1)：分別將小鼠單獨(dú)放入敞開(kāi)的行為箱(底邊長(zhǎng)44 cm×44 cm的方形行為箱或半徑為25 cm的圓形行為箱)中，自由探索5 min。探索完畢后將小鼠取出，放回飼養(yǎng)籠中。清理行為箱中小鼠的糞尿，75%酒精擦拭，消除異味。本階段在實(shí)驗(yàn)第一天上午、下午分別進(jìn)行一次。階段2(T2)：分別在行為箱的兩個(gè)相對(duì)的區(qū)域中放入2個(gè)完全相同的物體(物體1和1’), 再次將小鼠放入行為箱中探索5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，徹底清理行為箱。本階段實(shí)驗(yàn)在第二天上午進(jìn)行。階段3(T3)：物體1不變(舊物體)，物體1’更換為物體2(新物體)，再次將小鼠放入行為箱中探索5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，徹底清理行為箱。本階段實(shí)驗(yàn)在第二天下午進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均在上午8點(diǎn)至下午5點(diǎn)之間進(jìn)行。

圖1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 The schematic diagram of novel object recognition test

采用動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)記錄分析T2和T3中小鼠分別探索2個(gè)物體的時(shí)間，其中探索物體1的時(shí)間記為F，探索物體1’或2的時(shí)間記為N，探索兩個(gè)物體的總時(shí)間記為F+N，計(jì)算小鼠對(duì)物體1’和2的分辨比(discrimination ratio，DR)[DR=N/(N +F)×100%]。探索定義為小鼠面朝物體，鼻子與該物體的距離≤2 cm。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠性別對(duì)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在T2階段，各行為箱中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)物體1和1’的探究時(shí)間：(31.16±16.75) s，(30.97±16.50) s; (30.37±15.95) s,(31.73±15.10) s;(112.33±48.26) s,(112.50±49.76) s;(112.61±47.93) s,(112.32±47.10) s基本相同(P>0.05)，在T3階段，各行為箱中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)物體2的探索時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)物體1的探索時(shí)間(P<0.05)見(jiàn)圖2，但相同形狀的行為箱(方形行為箱, 圓形行為箱)中不同性別小鼠對(duì)2號(hào)新物體的DR無(wú)顯著性差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 T3階段4組小鼠對(duì)1和2號(hào)物體的 探索時(shí)間(*P<0.05, **P<0.01)Fig.2 The exploration times of object 1 and 2 of mice in T3 period(*P<0.05, **P<0.01)

圖3 相同行為箱中雌雄小鼠的分辨比Fig.3 The discrimination ratio of female and male mice in the same experimental condition

2.2 行為箱形狀對(duì)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在T2階段，不同形狀行為箱中小鼠對(duì)兩物體在5 min內(nèi)探索時(shí)間(30.76±15.93) s,(31.35±15.40) s; (112.47±46.81) s,(112.41±47.16) s的差異未達(dá)到顯著水平(P>0．05)；在T3階段，小鼠對(duì)2號(hào)物體的探索時(shí)間顯著長(zhǎng)于1號(hào)物體，但兩種形狀行為箱中小鼠對(duì)新物體的分辨比無(wú)顯著差異(P>0．05)見(jiàn)圖4。T2、T3兩階段中，圓形行為箱中小鼠對(duì)兩物體的探索總時(shí)間(224.88±37.05) s，(229.15±33.38) s顯著長(zhǎng)于方形行為箱中小鼠對(duì)兩物體的總探索時(shí)間(62.11±23.30) s，(65.58±22.40) s(P<0.01)見(jiàn)圖5。

圖4 兩種行為箱中小鼠對(duì)新物體的分辨比Fig.4 The discrimination ratio of novel object in mice about two types of experimental conditions

圖5 T2和T3階段各行為箱中的總探索時(shí)間(**P<0.01)Fig.5 The total exploration times of each experimental condition in T2 and T3 periods(**P<0.01)

3 討論

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是在模仿測(cè)試人類失憶癥的識(shí)別任務(wù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，評(píng)價(jià)的是嚙齒動(dòng)物對(duì)物體的識(shí)別記憶能力。該模型是建立在嚙齒動(dòng)物對(duì)新異物體的自發(fā)探索行為的基礎(chǔ)上，且該模型不像迷宮學(xué)習(xí)中必須剝奪動(dòng)物飲食或在避免水淹動(dòng)機(jī)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶[6]，也不像被動(dòng)回避測(cè)試中給予動(dòng)物電擊等負(fù)性強(qiáng)化讓動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶[7]。所以該模型最大的優(yōu)點(diǎn)就在于可以讓動(dòng)物在完全自然的狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測(cè)試，能夠更好地模擬人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶行為[8]。因此，該模型越來(lái)越多地用在評(píng)估藥物對(duì)記憶的作用研究上。

在新物體實(shí)驗(yàn)方法的使用中，如何規(guī)范實(shí)驗(yàn)流程，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)成了實(shí)驗(yàn)的核心問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較采用不同形狀的行為箱進(jìn)行新物體實(shí)驗(yàn)時(shí)結(jié)果的差異，推斷行為箱形狀對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中，T2階段的兩個(gè)物體完全相同，且對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)均為首次接觸，因此各組小鼠對(duì)物體的DR值均在50%左右，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)位置偏愛(ài)異常發(fā)生，即實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)兩個(gè)不同位置上的相同物體興趣相同。T3階段，小鼠對(duì)2號(hào)物體的探索時(shí)間顯著長(zhǎng)于1號(hào)物體,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中選用的新物體引起了小鼠的探索興趣，物體的選擇正確。各行為箱中，雌雄小鼠對(duì)新物體的分辨比無(wú)差異，表明不同性別的實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)新物體的分辨程度相同，即性別不影響對(duì)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在T3階段中，不同形狀的行為箱中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均能對(duì)新物體顯示出積極的探索興趣，分辯比相似，表明行為箱的形狀差異不影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)新物體識(shí)別行為。但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在兩種形狀的行為箱中的總探索時(shí)間存在差異，說(shuō)明行為箱的形狀對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的活動(dòng)程度有一定的影響。這可能是由于方形行為箱的角落效應(yīng)造成的。

研究結(jié)果表明，雖然在兩種不同形狀的行為箱中進(jìn)行的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物對(duì)新物體識(shí)別結(jié)果無(wú)差異，但為了避免角落造成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)能力降低現(xiàn)象的發(fā)生，我們認(rèn)為采用圓形行為箱進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋鼫?zhǔn)確地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)新物體的識(shí)別能力。