深Ⅱ度燙傷后小型豬皮膚愈合的組織病理學(xué)研究*

邱 波 王 艷 鄭曉霞 張海靜 張 鑫 王鳳乾 胡建廷

(1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 2501010) (2. 山東英才學(xué)院，濟(jì)南 250104)

燙傷是外科常見的創(chuàng)傷性疾病，大多數(shù)燙傷多為Ⅱ度以下的中、小面積燙傷[1]。為了更好地研究人類皮膚燙傷這一外科常見疾病，選擇符合臨床發(fā)病過程和創(chuàng)面主要因素的動(dòng)物模型至關(guān)重要[2-4]。研究燙傷動(dòng)物模型應(yīng)選用與人體結(jié)構(gòu)、功能、代謝及特征相似的動(dòng)物。小型豬皮膚組織結(jié)構(gòu)與人類很相似[5]，包括體表毛發(fā)的疏密、表皮厚薄、皮下脂肪層、表皮形態(tài)學(xué)和增生動(dòng)力學(xué)(豬30 d，人21 d)，以及皮膚燒傷后的體液和代謝變化等均非常相似，是進(jìn)行各種皮膚創(chuàng)傷動(dòng)物模型制備的理想選擇。文獻(xiàn)報(bào)道的燙傷模型制備方法有電熱燙傷和恒溫恒壓電燙傷，這些方法在運(yùn)用當(dāng)中各有其優(yōu)缺點(diǎn)[6-8]。本研究參考上述燙傷方法的條件，使用恒溫燙傷儀，將恒溫燙傷儀探頭于110 ℃下，持續(xù)接觸20 s，壓力約1 000 g，于巴馬小型豬背部脊柱側(cè)制備深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，每個(gè)燙傷創(chuàng)面面積約為20 cm2。分別在第1、3、7、14、21、28天觀察皮膚創(chuàng)傷愈合情況，根據(jù)皮膚組織愈合的規(guī)律及實(shí)驗(yàn)的可操作性，選擇在第1、

14、28天取樣，利用HE、Masson染色及免疫組化CD31染色的方法觀察皮膚在不同時(shí)間點(diǎn)修復(fù)的動(dòng)態(tài)病理學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源與飼養(yǎng)環(huán)境

巴馬小型豬普通級，12只，雌雄各半，4～6月齡，平均體質(zhì)量14.6 kg，體長約65 cm，體高32 cm左右，胸圍55 cm；由北京實(shí)創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2013 0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：111014000000241，試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以上。

飼養(yǎng)條件：巴馬小型豬置不銹鋼籠中于普通級環(huán)境飼養(yǎng)，每籠1只。室溫19～26 ℃，濕度40%～70%，日溫差≤4 ℃，換氣次數(shù)8～10次/h，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(魯)2014 0008。

1.2 試劑及儀器

蘇木素-伊紅(HE) 染色液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。 SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫組化試劑盒，規(guī)格：18 mL，批號：AG08164417，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。HT15-1KT Masson染色試劑盒，規(guī)格：50 mL，批號：20170710，由美國SIGMA-ALDRICH公司生產(chǎn)。

YLS-5Q臺式超級溫控燙傷儀，由濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

分別在燙傷后第1、3、7、14、21、28天觀察皮膚創(chuàng)傷愈合的肉眼形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行創(chuàng)面愈合率的測定。創(chuàng)面愈合率的測定方法為在巴馬小型豬燙傷后第1、3、7、14、21、28天，分別對創(chuàng)面進(jìn)行拍照，用ImageJ圖像分析系統(tǒng)測算創(chuàng)面愈合殘留面積(newarea at interval time，AI)與愈合面積百分率(healing rate，HR)，HR=(AO-AI)/AO×100%，AO(original incisional area)為燙傷后第1天創(chuàng)面面積[9]。選擇在第1、14、28天的皮膚創(chuàng)面上分別切取約1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，經(jīng)10%甲醛液固定進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、石蠟切片、HE染色，并根據(jù)說明書步驟分別進(jìn)行免疫組化CD31染色和Masson 染色[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)(P≤0.05)，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面大體觀察

燙傷制備后，創(chuàng)面呈現(xiàn)與燙傷探頭形狀相同的圓形，創(chuàng)面發(fā)白，無光澤，偶見輕微出血，燙傷創(chuàng)面與周圍組織界限明顯，略低于周圍正常皮膚，質(zhì)地較軟，無滲出及分泌物。燙傷后第1天至7天，燙傷表面逐漸由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色，無異味及分泌物，質(zhì)地逐漸變硬，多數(shù)創(chuàng)面形成焦痂，觸之皮革感。第7天至第14天，燙傷創(chuàng)面全部形成灰色焦痂，創(chuàng)面面積有收縮趨勢，有少量創(chuàng)面焦痂部分脫落，脫落后的皮膚呈粉紅色，觸之柔軟。燙傷第14天至28天，燙傷傷口逐漸脫痂，完成再上皮化，脫痂后皮膚多數(shù)呈暗紅色，少數(shù)與正常皮膚顏色相同。創(chuàng)面處有毛發(fā)生長。圖1 A-F分別為燙傷后第1、3、7、14、21、28天后的肉眼形態(tài)學(xué)觀察。

圖1 小型豬背部皮膚燙傷后不同時(shí)期的肉眼形態(tài)學(xué)觀察Fig. 1 The gross morphology of skin wound healing of Minipig after deep second degree burn at different times

2.2 創(chuàng)面愈合率

對不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面進(jìn)行拍照，用ImageJ圖像分析系統(tǒng)測算創(chuàng)面愈合殘留面積(newarea at interval time，AI)與愈合面積百分率(healing rate，HR)，巴馬小型豬背部皮膚燙傷后不同時(shí)期的愈合率見表1。由表1可見，雄性豬與雌性豬相比，雄性豬燙傷創(chuàng)面的愈合速率較快。

2.3 組織病理學(xué)

燙傷皮膚分別經(jīng)HE、Masson、CD31染色方法進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，圖2A-C顯示損傷已經(jīng)累積到真皮深層，達(dá)到深Ⅱ度燙傷的標(biāo)準(zhǔn)。圖2D-L顯示燙傷后皮膚組織分別在第14天和第28天修復(fù)的組織病理學(xué)變化。具體組織病理學(xué)變化見圖2。

表1 巴馬小型豬背部皮膚燙傷后不同時(shí)期的愈合率Table 1 Healing rate at different periods after burn on the skin of Ba-Ma Minipig’s back

圖2 巴馬小型豬深Ⅱ度皮膚燙傷后的病理組織學(xué)觀察注：A：燙傷第1天：創(chuàng)面表皮全層變性壞死脫落(三角形所示)，真皮深層呈凝固性壞死.(HE，×40);B：真皮層內(nèi)膠原纖維腫脹變性呈均質(zhì) 紅染條索狀(箭頭所示).(Masson染色，×100);C：真皮深層顯示未見標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞(三角形所示).(CD31染色，×100);D：圖C 高倍鏡下觀察(三角形所示).(HE，×200);E：燙傷第14天：創(chuàng)面由新生表皮覆蓋，表皮局灶性上皮島增生(箭頭所示)，還可見表皮上方 的結(jié)痂(三角形所示).(HE，×40);F：真皮深層內(nèi)有少量淡染的膠原纖維(箭頭所示).(Masson染色，×100);G：燙傷第14天：創(chuàng)面有少 量血管(箭頭所示).(CD31染色，×100);H：圖G的高倍鏡下觀察(箭頭所示).(HE，×200); I：燙傷第28天：創(chuàng)面完全由新生表皮覆蓋 (三角形所示)，真皮深層內(nèi)含有較多的肉芽組織.(HE，×40); J：真皮深層內(nèi)有多量淡染的膠原纖維(三角形所示).(Masson染色，×100); K：燙傷第28天，創(chuàng)面有大量血管(箭頭所示).(CD31染色，×100); L：圖K的高倍鏡下觀察(箭頭所示).(HE，×200)Fig. 2 Histopathological observation on skin wound healing of minipig after deep second degree burnNote： A:On the first after burn,The epidermis show degeneration, necrosis and exfoliation (triangle), dermal manifeste as coagulative necrosis.(HE,×40); B:Collagen fibers in the layer of the dermis show swelling and degeneration, stained homogene ous red dyed cords(arrow). (Masson,×100); C:CD31 staining showed there is no blood vessel(triangle)(CD31 staining，×100); D:Higher magnification of FigureC (triangle). (HE,×200); E:On the 14th post burn, the wound covered with the newly grown epithelium, epithelial islands hyperplasia (arrow)and scab(triangle). (HE,×40); F:A small amount of lightly stained collagen fibers in the deep dermis (arrow). (Masson,×100); G: On the 14th, a little of blood vessel can be seen in the wound.(CD31,×100); H:Higher magnification of FigureG (arrow). (HE,×200); I:On the 28th, The wound is completely covered by the new epidermis(triangle), the more granulation tissue is present in the deeper layer of the dermis. (HE,×40); J:Lightly stained collagen fibers in the deep dermis (triangle).(Masson,×100); K: On the 28th, a great many blood vessel can be seen in the wound. (CD31,×100); L:Higher magnification of FigureK(arrow). (HE,×200)

3 討論

皮膚創(chuàng)傷愈合包括各種組織的再生和肉芽組織增生、瘢痕組織形成的復(fù)雜組合，表現(xiàn)出各種過程的協(xié)同作用。而不同層次和深度的皮膚燙傷引起的組織細(xì)胞變性壞死，會決定創(chuàng)面的修復(fù)方式，并直接影響皮膚的預(yù)后[11]。對于人的皮膚來說：如Ⅰ度燙傷因?yàn)榛准?xì)胞健在，無需特殊治療，不影響預(yù)后，無疤痕；淺Ⅱ度燒傷累積表皮全層和部分真皮淺層乳頭層，真皮層中的毛囊、汗腺和皮脂腺等附屬器健在，2 周內(nèi)可以自愈；而深Ⅱ度燒傷累積到真皮深層，真皮層中還有部分的毛囊、汗腺和皮脂腺等附屬器健在，需要3～5周才能康復(fù)。

本試驗(yàn)通過對燙傷創(chuàng)面的組織學(xué)檢查，證實(shí)損傷已經(jīng)累積到真皮深層，建立了豬深Ⅱ度燙傷模型。隨后觀察深Ⅱ度燙傷的皮膚在不同時(shí)間點(diǎn)修復(fù)的病理學(xué)變化。肉眼形態(tài)學(xué)觀察，燙傷后第1天至7天，燙傷表面逐漸由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色，無異味及分泌物，質(zhì)地逐漸變硬，多數(shù)創(chuàng)面形成焦痂，觸之皮革感。第7天至第14天，燙傷創(chuàng)面全部形成灰色焦痂，創(chuàng)面面積有收縮趨勢，有少量創(chuàng)面焦痂部分脫落，脫落后的皮膚呈粉紅色，觸之柔軟。燙傷第14天至28天，燙傷傷口逐漸脫痂，完成再上皮化，脫痂后皮膚多數(shù)呈暗紅色，少數(shù)與正常皮膚顏色相同。創(chuàng)面處有毛發(fā)生長。愈合率結(jié)果顯示，雄性豬燙傷創(chuàng)面的愈合速率較快。組織病理學(xué)變化顯示，燙傷后第1天，燙傷早期時(shí)創(chuàng)面表皮全層變性壞死脫落，真皮深層組織呈凝固性壞死，壞死組織內(nèi)的膠原纖維經(jīng)Masson染色染為橘紅色，也未見標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞。燙傷后第14天，以肉芽組織增生為主。創(chuàng)面基本由新生表皮覆蓋，表皮中局灶性上皮島增生，皮膚附件修復(fù)良好。真皮深層中可見新生的肉芽組織及少量的膠原纖維生成，肉芽組織內(nèi)血管數(shù)量相對較少。燙傷第28天，皮膚已經(jīng)基本愈合。除表皮各層相對成熟外，真皮層內(nèi)還含有肉芽組織及膠原纖維，肉芽組織內(nèi)的血管數(shù)量及膠原纖維的含量均較燙傷后第14天增多，但該時(shí)期內(nèi)皮膚組織還未完全成熟，此期內(nèi)肉芽組織還是在向瘢痕組織進(jìn)行轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)變過程可能還需要一段時(shí)間來完成皮膚組織的完全修復(fù)。