海藻糖脂的合成及應用前景

張博涵，沈新樂，胡 燚，唐蘇蘇

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇南京211800； 2.南京工業(yè)大學藥學院，江蘇南京211800)

海藻糖脂(trehalose lipids,trehalolipids)是一類具有表面活性的化合物，由親水和疏水兩部分組成，親水部分是海藻糖，疏水部分主要是脂肪酸[1]。自然界中，海藻糖脂主要分布于革蘭氏陽性、高GC含量的放線菌中，如分枝桿菌(Mycobacteria)、諾卡氏菌(Nocardia)、紅球菌(Rhodococcus)和棒狀桿菌(Corynebacteria)[2-5]。其中，海藻糖-6,6′-二霉菌酸脂(TDM)、海藻糖-6-霉菌酸脂(TMM)和琥珀酰海藻糖脂(STL)最常見，前兩者結構見圖1和2。海藻糖脂是一類生物表面活性劑，與化學表面活性劑相比，具有低毒性、高穩(wěn)定性、耐酸耐鹽性、生物可降解、環(huán)境友好及抗菌性等優(yōu)勢。和其他糖脂一樣，海藻糖脂的研究工作已歷經幾十年，但尚未進行大規(guī)模生產及應用，主要原因是生產成本高、產量低和產品結構多變等。本文中，筆者將對海藻糖脂的合成方法及應用價值進行概述和探討。

圖1 海藻糖-6,6′-二霉菌酸脂和海藻糖-6-霉菌酸脂F(xiàn)ig.1 Trehalose 6,6′-dimycolate and trehalose-6-monomycolate

圖2 琥珀酰海藻糖脂F(xiàn)ig.2 Succinoyltrehalose lipid

1 合成方法

1.1 化學合成法

海藻糖脂的傳統(tǒng)合成途徑是化學合成。由于糖環(huán)上的羥基眾多，反應過程中會伴有副產物產生。為避免這一現(xiàn)象，主要采取的合成策略有兩種，一種是使用保護基團保護海藻糖的伯羥基不被芐基化，隨后去除保護基團并進行?；饔肹6-10]；另一種是選擇性地將海藻糖的一部分伯羥基轉化為硫酸鹽或鹵化物，通過SN2取代反應，使用羧酸鹽為酰基供體，獲得目的產物[11-12]。上述兩種方法的缺點在于反應步驟繁瑣，反應時間長且成本昂貴，因此不利于推廣和應用。不過，對于結構相對簡單的海藻糖單脂和二脂，其合成過程相對簡單。Paul等[13]使用O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)催化海藻糖，分別與己酸、棕櫚酸和油酸在室溫下反應獲得海藻糖脂。當脂肪酸輕微過量時，產物中海藻糖單脂的占比可達65%～69%，當脂肪酸與海藻糖摩爾比大于2時，海藻糖二脂的占比為63%～70%，且海藻糖脂反應時間隨脂肪酸鏈鏈長增加而增加。圖3為化學合成海藻糖脂的示意圖。

圖3 化學法催化合成海藻糖單脂和海藻糖二脂F(xiàn)ig.3 Chemical synthesis of trehalose mono- and di-esters

1.2 生物合成法

1.2.1 全細胞合成法

全細胞合成法又稱微生物發(fā)酵法，是利用細胞中的多酶聯(lián)合催化獲得目標產物的方法，通過工業(yè)發(fā)酵可實現(xiàn)大規(guī)模生產，其生產水平主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件。人們對于海藻糖脂生產菌的研究已有幾十年之久，研究工作最為廣泛的是紅球菌(Rhodococcus)。表1中列舉了幾類海藻糖脂及其生產菌。為了滿足海藻糖脂的商業(yè)化應用條件，首先應采取的經濟策略是降低成本。用于微生物發(fā)酵的培養(yǎng)基是決定能否用于產業(yè)化生產的決定因素之一，通常占生物表面活性劑生產成本的50%，所以理想的方案是用廉價的原料獲得最多的產品。另外，還可以通過對表面活性劑生產菌株的結構改造獲得高產菌種。

表1 海藻糖脂生產菌及其主要產物類型

1)營養(yǎng)條件優(yōu)化。目前的研究表明，大部分海藻糖脂生產菌以正烷烴為主要碳源，且烷烴的種類影響產物中海藻糖脂的化學結構。當烷烴的碳鏈長為C14～C16，特別是正十六烷時，海藻糖脂產率最高[16]，圖4為RhodococcuserythropolisDSM 43215的海藻糖脂生物合成途徑[22]。雖然正烷烴是公認的最佳碳源，可以保證菌體的生長和海藻糖脂的合成，但其價格昂貴。因此，有必要尋找一類價格低廉的替代原料。目前的研究證明：植物油[23]、廚余垃圾[24]、農業(yè)廢料和食品輕工廢料均可作為原料替代物培養(yǎng)微生物生產生物表面活性劑。Espuny等[25-26]使用烷烴和廢潤滑油混合物作為唯一碳源，培養(yǎng)Rhodococcussp. 51T7，所得海藻糖脂產量為0.48～1.12 g/L。隨后該團隊又對該菌培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后NaNO3、K3PO4和Fe2(SO4)3的質量濃度分別為2.5、1.5和0.01 g/L，最終海藻糖脂的產量增加至3 g/L。何海洋等[27]用食用油替代十六烷作為Dietziacinnamea7517d的碳源，優(yōu)化后產量達756.4 mg/L，較發(fā)酵基礎培養(yǎng)基提高了9.4倍，該文獻中作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的食用油價格為14.8元/L，僅為正十六烷價格的0.5%。

圖4 Rhodococcus erythropolis DSM 43215中的海藻糖-6,6′-棒桿菌分枝菌酸二酯的合成途徑Fig.4 Trehalose dicorynomycolate synthesis pathway from n-tetradecane by Rhodococcus erythropolis DSM 43215

2)培養(yǎng)條件優(yōu)化。發(fā)酵過程是生產過程中重要的一環(huán)，通過優(yōu)化底物的配比可控制微生物細胞達到適宜菌體量，從而使海藻糖脂達到最大積累量。Uchida等[28]研究發(fā)現(xiàn)R.erythropolisSD-74在pH 7.0、高磷酸緩沖液濃度(0.3～0.4 mol/L)、高滲透壓(2%NaCl)條件下能使海藻糖脂產量提高，發(fā)酵10 d后產量可達40 g/L。Mutalik等[29]使用響應面分析法改進了Rhodococcusspp.MTCC 2574的發(fā)酵過程，優(yōu)化后含海藻糖脂的表面活性劑混合物產量由3.2 g/L提高到10.9 g/L。

3)高產微生物的篩選與重組。除了對外部因素的優(yōu)化，微生物菌種的遺傳特性也是決定高效發(fā)酵生產的重要因素。通過誘變育種和基因工程技術獲得海藻糖脂高產微生物菌株是提高工業(yè)生產水平的關鍵。Inaba等[30]對生產STL的Rhodococcussp. SD-74的合成途徑進行了分析，研究發(fā)現(xiàn)STL合成途徑與3種基因密切相關，并對其中的酰基輔酶A轉移酶基因tlsA進行過表達，改造后菌種的STL產量相比之前提高了2倍。Dogan等[31]將透明顫菌中的血紅蛋白基因插入到污泥戈登氏菌(Gordoniaamarae)中，提高了菌體的生長和海藻糖脂的合成，結果顯示海藻糖脂產量約為80 mg/L，提高了4倍左右。

國內外對于生物表面活性劑的全細胞合成研究工作已有數(shù)十年之久，但針對海藻糖脂的工業(yè)化生產研究還處于初級階段。培養(yǎng)基中碳源的成本是海藻糖脂生產成本高居不下的主要原因，目前對于海藻糖脂生產菌的碳源替代物的研究尚不成熟，不足以支撐微生物合成海藻糖脂的工業(yè)化應用。日后的研究工作應加強這方面的研究，并引入誘導等調控機制，降低海藻糖脂的生產成本并提高產量。

1.2.2 酶促合成法

酶促合成法是近年研究的熱點，它具有催化效率高、反應條件溫和、反應專一性強，副反應少及產物容易分離純化等特點，但酶制劑的價格昂貴。從反應機理考察，合成糖脂的反應類型主要分為兩類，即酯化反應和轉酯化反應。酯化反應是利用酶催化糖和脂肪酸發(fā)生酯化反應得到對應的酯；轉酯化反應是利用酶催化糖和一些簡單的酯反應，得到對應的糖脂。由于熱力學限制，糖脂合成反應不適宜在水相中進行。事實上，酶分子表面需要接觸少量的水分子才能夠維持具有催化活性所必需的構象。因此，非水相介質并不是嚴格意義上的無水，而是含有極少量的水，換句話說，其實是微觀上的微水相反應。

1)有機溶劑體系。有機溶劑作為介質的酶催化反應是近年來研究最多的體系，它操作簡單，反應條件溫和且易于控制。催化合成海藻糖脂的酶包括脂肪酶和蛋白酶。這些酶對海藻糖的C6-OH有區(qū)域選擇性。由于海藻糖脂的對稱結構，在反應物充足的情況下，脂肪酶如Novozym 435傾向于催化合成海藻糖二脂[32]；來源于枯草芽孢桿菌屬的蛋白酶能在極性較強的有機介質中催化合成海藻糖單脂[33]。鑒于海藻糖脂是極性有機物，為保證其溶解效果，溶劑需具有一定極性，但溶劑的極性過強會降低長鏈脂肪酸的溶解效果和導致脂肪酶失活[34]。因此，尋找一種合適的有機介質體系是整個反應的關鍵所在。強極性溶劑中加入弱極性溶劑能促進反應物溶解、維持酶活，還能影響產物中糖脂的類型。Hsieh等[35]以體積比4∶ 1的DMSO/叔戊醇混合溶液為介質，用Novozym 435催化海藻糖和硫辛酸的酯化反應，底物摩爾比1∶ 4，溫度40 ℃，反應4 d后得到的產物為6-海藻糖硫辛酸酯，轉化率為(75.9±1.9)%。此外，底物的摩爾比也會影響產物組成。Woudenberg等[32]以叔丁醇為溶劑，南極假絲酵母脂肪酶為催化劑，分別研究了海藻糖與丁酸乙脂和十二酸乙酯的酯交換反應，結果表明底物中酯/糖的摩爾比越大，產物中的二酯/單酯轉化率之比就越高。丁酸乙脂和十二酸乙酯與海藻糖的摩爾比為48.5時，產物中海藻糖二酯/單酯的轉化率之比分別為72/12和80/3。

2)無溶劑體系。與傳統(tǒng)有機溶劑反應體系相比，無溶劑體系以純底物作為溶劑，底物濃度高、反應速度快、產品得率高，又因避免使用(或少量使用)有機介質，有效地減少了后處理步驟，既降低生產成本，又減少環(huán)境污染，適于產品的大批量生產?；谏鲜鰞?yōu)勢，無溶劑體系中脂肪酶催化研究越來越受到青睞。鐵翠娟等[36]以吸附在硅藻土上的假絲酵母脂肪酶為催化劑，在無溶劑體系中合成海藻糖6,6′-二月桂酸酯，溫度47 ℃、pH 7.0、月桂酸與海藻糖的摩爾比大于6時，酯化反應的轉化率較高，反應36 h轉化率達95 %以上，產物純度為90%～95%。

除上述2種技術外，還有一些最新的技術如離子液體技術尚未用于海藻糖脂的合成研究，具有研究價值。目前為止，大部分實驗室和工業(yè)生產制備糖脂，還停留在化學合成階段，與之相比，酶促合成法為高效、高區(qū)域選擇性地合成糖酯類化合物提供了一條行之有效的途徑，大幅度提高糖脂的轉化效率并降低分離純化成本。另外，與微生物方法相比較，酶促合成可以從糖類和脂肪酸等價廉易得的原料出發(fā)合成酯化位置特定的糖脂，產物單一、副產物少，但其缺點是酶的成本較高，而且酶法合成的表面活性劑多是一些結構相對簡單的分子。但對于特殊結構的海藻糖脂，仍需要借助另外兩種技術，限制了酶法合成的工業(yè)化應用。

2 應用前景

2.1 生物醫(yī)學領域的應用

2.1.1 抗菌和抗病毒活性

糖脂類生物表面活性劑可以溶解細菌的細胞壁，所以具有一定的抗菌活性。由于細菌細胞壁組成及結構的差異，海藻糖脂對革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌有更顯著的抑制作用[37]。其作用機理可能與脂肪酸破壞微生物的細胞結構，導致細胞內容物流出，或擾亂了與生物膜相關的呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)有關。海藻糖脂在質量濃度為300 mg/L時，能夠抑制絲狀真菌分生孢子萌發(fā)[38]。有研究發(fā)現(xiàn)STL在質量濃度為11～33 mg/L時，能夠抑制單純皰疹病毒和流感病毒繁殖[28,39]。

2.1.2 免疫學活性

海藻糖脂在免疫學方面的研究已經進行了幾十年之久[5,21,40]。其中最早被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的是海藻糖二霉菌酸醋(TDM)[41]，它能刺激早期體液和細胞免疫，誘導產生趨化因子(如，MCP-1、MIP-1α、IL-8)和細胞因子(如，IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10)。海藻糖二山崳酸脂(TDB)及其類似物，可用作陽離子脂質體佐劑，輔助疫苗引起細胞免疫，刺激CD4+T細胞應答。CAF01(cationic adjuvant formulation)是一種基于表面活性劑二甲基雙十八烷基銨(DDA)溴化物和TDB的陽離子脂質體佐劑。經一期臨床試驗，CAF01與重組肺結核融合抗原Ag85B-ESAT6 (NCT 編號：NCT00922363)、HIV-1縮氨酸混合物(NCT 編號：NCT01141205、NCT01009762)結合后安全性和穩(wěn)定性良好[42-43]?；诤Ｔ逄侵c免疫細胞分子的作用機制，人們未來將有可能研發(fā)出針對癌癥和一些免疫防御疾病的新型免疫療法。在其他領域的應用中，限制糖脂類生物表面活性劑應用的最主要因素是它們的生產和下游處理的成本過高。然而在醫(yī)藥領域，成本并不是首要的考察標準，因此，海藻糖脂在這方面的開發(fā)潛力非常之大。

2.2 食品領域的應用

糖脂類化合物因其高度的安全性和良好的表面活性等優(yōu)點，已相繼被聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織(FAO)、世界衛(wèi)生組織(WHO)、歐盟、美國、日本和中國等組織和國家批準作為食品添加劑。海藻糖脂的抑菌作用可用于食品防腐劑。張慶等[44-46]研發(fā)出一種新型食品防腐劑，主要成分是富馬酸海藻糖甲酯(TMF)，具有高的抗菌活性及防霉性能。TMF抑菌譜廣，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、牛奶酸敗混合菌、啤酒酵母和面包酵母等常見微生物的生長有良好的抑制作用，其最低抑菌濃度(MIC)分別為0.08、0.07、0.07、0.06、0.04和0.03，并且可在pH 3～9范圍內保持良好的抗菌活性；對混合菌群的抑菌能力優(yōu)于富馬酸單甲酯(MMF)，接近苯甲酸，還對油脂具有一定的抗氧化能力。

2.3 化妝品領域的應用

海藻糖脂具有良好的乳化性、分散性、增溶性等性能，能使油脂、藥物成分及化妝品其他成分分散穩(wěn)定，因此適合作為化妝品的乳化劑和乳化穩(wěn)定劑。日清奧利友集團研制出一種海藻糖脂組合物，其熱穩(wěn)定性優(yōu)異、對各種蠟具有優(yōu)異的硬度調整作用，相對于各種化妝品，可與蠟一起作為固形劑使用，且可賦予配合的化妝品優(yōu)異的保型性和良好的使用感及妝的持久性[47]。

2.4 生物修復領域的應用

工業(yè)生產中排放的疏水性有機化合物很容易與土壤顆粒結合，從而導致可溶性降低，如何有效地處理這類化合物已經成為一大難題。海藻糖脂等生物表面活性劑能提高有機化合物的溶解度，使污染物分散、增溶和乳化，進而促進污染物盡快地降解。從污染地區(qū)土壤中篩選出最多的海藻糖脂生產菌是紅球菌，可應用于修復污染土壤[48-49]，研究表明，由銅綠假單胞菌合成的海藻糖脂使阿拉斯加原油污染物的降解率大大提高，30 ℃時其驅油效果是水的2～3倍。

2.5 石油工業(yè)領域的應用

海藻糖脂可降低原油與水兩相的界面張力，從而提高油田的開采量。Wintershall公司在北海油田進行提高原油采收率試驗，質量濃度為50 mg/L的海藻糖脂能讓驅油效果提高30%，與一般化學表面活性劑相比，驅油效果增大了5倍。目前化學合成表面活性劑在油田生產中已經得到穩(wěn)定應用，但對于生物表面活性劑驅油機制的認識仍處于摸索階段，其驅油活性和無害可回收等性質成為未來的技術發(fā)展方向[51]。在石油工業(yè)和生物修復領域，不需要嚴格控制海藻糖脂的純度和毒性，因此分離純化成本低，但是對產量和生產成本的要求較高。所以，對于大規(guī)模推廣應用還需深入研究。

3 結論與展望

近十年來，海藻糖脂的研究與發(fā)展步入了新的階段。如今人們已發(fā)現(xiàn)并分離了多種不同結構的海藻糖脂以及生產菌株。合成技術也從傳統(tǒng)的化學合成逐漸轉變?yōu)槿毎铣珊兔阜ê铣?。研究證明，海藻糖脂在生物醫(yī)學、食品、化妝品、環(huán)境修復和石油工業(yè)等領域具有廣泛的潛在應用價值，其在生物醫(yī)學領域的應用前景更是處于領先地位。糖脂生物表面活性劑具有其他表面活性劑無法比擬的優(yōu)勢，但是這些優(yōu)勢還不足以支撐大規(guī)模生產。為了像其他生物技術產品一樣得到廣泛應用，進行基礎研究的同時還必須要考慮海藻糖脂可能帶來的商業(yè)應用價值和效益。只有解決這些難題，與海藻糖脂有關的產品才會達到市場預期的要求，成為快捷、實惠、環(huán)保的生物表面活性劑。