鹽單胞菌S62 β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的研究

朱五二，繆明永，顧正華，李由然，丁重陽，石貴陽

(1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122； 2. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122； 3. 第二軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海200433)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)俗稱乳糖酶(lactase)，屬于糖基水解酶類(glycosyl hydrolases)，可以水解β-1,4-糖苷鍵，同時(shí)還具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶活性[1]，用于功能性食品低聚半乳糖(GOS)的合成。β-半乳糖苷酶廣泛存在于微生物(細(xì)菌、真菌和酵母)、植物(尤其是杏仁、桃、杏和蘋果)和動(dòng)物器官中[2-4]。微生物酶具有較高的生產(chǎn)力，能降低生產(chǎn)成本。目前已有古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌和酵母的β-半乳糖苷酶研究報(bào)道[5]，從真菌(米曲霉和黑曲霉)和酵母(乳酸克魯維酵母和脆弱克魯維酵母)獲得的酶顯示出巨大的商業(yè)潛力，來自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶是使用最廣泛的酶之一[6-9]。

低聚半乳糖是以乳糖作為供體和受體底物，利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基化活性產(chǎn)生的具有高達(dá)9聚合度(DP)的寡糖混合物[9]，主要結(jié)構(gòu)由葡萄糖末端連接可變數(shù)目的半乳糖單元組成，半乳糖單元的數(shù)目通常為2～5[10]，半乳糖單元通過β(1→3)，β(1→6)和β(1→4)鍵連接，而半乳糖-葡萄糖鍵在大多數(shù)情況下是β(1→4)[11]。不同來源的酶合成低聚半乳糖是有差異的，其中低聚半乳糖主要包含三糖、四糖、五糖，以及異乳糖和半乳二糖[12]。

低聚半乳糖是一種調(diào)節(jié)結(jié)腸微生物菌群的益生元，具有改善礦物質(zhì)吸收和預(yù)防結(jié)腸癌的功效[13]。研究表明，低聚半乳糖大大增加了雙歧桿菌的數(shù)量及其在腸道中的代謝活性[14-16]，可降低過敏發(fā)生率[17-18]和病原體的黏附[15,18-19]，并且能介導(dǎo)腸道免疫系統(tǒng)。此外，低聚半乳糖有效治療代謝性疾病[20]。因此，低聚半乳糖廣泛應(yīng)用在飲料和嬰兒奶粉的配方中[21]。

我國目前仍存在β-半乳糖苷酶產(chǎn)量低的問題，從而限制了β-半乳糖苷酶在工業(yè)中的應(yīng)用。如何尋找一種高產(chǎn)、高酶活的β-半乳糖苷酶仍是國內(nèi)研究的難點(diǎn)。繆明永課題組的Wang等[22]對(duì)中國東海海水和海泥來源的海洋微生物進(jìn)行篩選，獲得了1株產(chǎn)S62β-半乳糖苷酶的鹽單胞菌S62(Halomonassp. S62)，并對(duì)其低溫β-半乳糖苷酶基因(GenBank登錄號(hào)JQ337961)進(jìn)行了重組表達(dá)研究。

在以上基礎(chǔ)上，筆者對(duì)S62β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反應(yīng)條件進(jìn)行探索，以獲得最大低聚半乳糖產(chǎn)率，以期為利用低溫β-半乳糖苷酶進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)低聚半乳糖提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

一水合乳糖、葡萄糖、半乳糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，TEDIA公司。

電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-Q-TOF-MS)、高效液相色譜儀(HPLC)，美國Waters公司。

1.2 低聚半乳糖的檢測

1.2.1 低聚半乳糖種類檢測

采用 Waters Acquity BEH Amide柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)分離，質(zhì)譜檢測器，時(shí)間為20 min。流動(dòng)相A相：80%乙腈加0.1%氨水；B相:30%乙腈加0.1%氨水。柱溫45 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。線性梯度洗脫程序見表1。

表1 LC-MS洗脫條件

注：質(zhì)譜離子化方式為負(fù)離子(ESI-)，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為20 V，脫溶劑氣溫度為400 ℃，脫溶劑氣流速為700 L/h，碰撞能量為6 eV，質(zhì)量范圍為10～1 000，檢測電壓為1 800 V。二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為6 eV，錐孔電壓為50 V，選擇離子質(zhì)荷比為341、503、665。

1.2.2 低聚半乳糖含量的檢測

實(shí)驗(yàn)采用雙柱法檢測[23-24]，并計(jì)算低聚半乳糖含量。

葡萄糖和半乳糖檢測：用伯樂公司的Aminex HPX-87C柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)測出葡萄糖和半乳糖含量，流動(dòng)相為純水，檢測器為示差檢測器，流速為0.6 mL/min，柱溫為50 ℃，檢測器靈敏度為8，檢測器溫度為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

乳糖檢測：使用Waters公司的Amide柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)測出乳糖含量，流動(dòng)相為70%乙腈，檢測器為示差檢測器，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測器靈敏度為8，檢測器溫度為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

低聚半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算見式(1)。

w(GOS)=w(Lac)-w1(Gal)-w1(Glu)-
w(H+)-w1(Lac)

(1)

式中：w1(Gal)=w(Gal)×(180-17)/180；

w1(Glu)=w(Glu)×(180-1)/180；

w(H+)=[n(Glu)-n(Gal)]×1。

w(Gal)、w(Glu)、w(Lac)、w1(Lac)分別為水解半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、初始乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)后乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)；n(Glu)、n(Gal)分別為葡萄糖和半乳糖的摩爾數(shù)。

乳糖消耗率和低聚半乳糖產(chǎn)率的計(jì)算見式(2)和(3)。

乳糖消耗率=w1(Lac)/w(Lac)×100%

(2)

低聚半乳糖產(chǎn)率=w(GOS)/w(Lac)×100%

(3)

1.3 單因素條件優(yōu)化

1.3.1 pH對(duì)低聚半乳糖合成的研究

用磷酸緩沖液配制pH為6.0～8.0的乳糖溶液，質(zhì)量濃度為250 g/L，用純水配制酶液600 U/mL，取1.9 mL乳糖溶液加入0.1 mL酶，在30 ℃下反應(yīng)6 h。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

1.3.2 底物濃度對(duì)低聚半乳糖合成的研究

采用單一變量法控制反應(yīng)，底物質(zhì)量濃度為150～350 g/L，pH為7.0，其他條件如1.3.1節(jié)所述。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

1.3.3 溫度對(duì)低聚半乳糖合成的研究

采用單一變量法控制反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25～45 ℃，pH為7.0，其他條件如1.3.1節(jié)所述。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

1.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚半乳糖合成的研究

采用單一變量法控制反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為4～12 h，pH為7.0，其他條件如1.3.1節(jié)所述。計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

1.3.5 加酶量對(duì)低聚半乳糖合成的研究

采用單一變量法控制反應(yīng)，加酶量為15～75 U/mL，pH為7.0，其他條件如1.3.1節(jié)所述，計(jì)算出低聚半乳糖產(chǎn)率及乳糖消耗率。

1.4 低聚半乳糖合成正交試驗(yàn)

在前期的基礎(chǔ)上，控制反應(yīng)時(shí)間為4 h，以溫度、底物濃度、pH、加酶量為考察因素，以低聚半乳糖含量為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)。

1.5 最適條件低聚半乳糖合成及酶穩(wěn)定性

在正交最適條件下進(jìn)行反應(yīng)8 h，定時(shí)取樣，使用HPLC測糖組分，并測定40 ℃下酶的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 低聚半乳糖種類鑒定

通過液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)鑒定S62β-半乳糖苷酶合成低聚糖的種類，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知：出峰時(shí)間8.71、9.17和9.72 min為3種二糖，其質(zhì)譜圖依次為b、c、d，分別為乳糖、異乳糖和半乳二糖；出峰時(shí)間11.30和12.25 min為2種低聚半乳三糖，質(zhì)譜圖為e、f；出峰時(shí)間13.51和14.23 min為2種低聚半乳四糖，質(zhì)譜圖為g、h。此前，Rodriguez-Colinas等[25]鑒定了來自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的低聚半乳糖混合物中的5種低聚半乳糖。Urrutia等[26]從米曲霉的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的低聚半乳糖混合物中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)種類。Yanahira等[27]從環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶產(chǎn)物中分離出11種低聚半乳糖。S62β-半乳糖苷酶以乳糖為底物合成了6種低聚半乳糖，可以看出S62β-半乳糖苷酶同樣具有較高的轉(zhuǎn)糖基酶活。

(a)—選擇離子色譜圖；(b)、(c)、(d)—二糖質(zhì)譜圖；(e)、(f)—三糖質(zhì)譜圖；(g)、(h)—四糖質(zhì)譜圖圖1 低聚半乳糖種類分析Fig.1 Analysis of types of GOS

2.2 pH對(duì)低聚半乳糖合成的影響

Torres等[5]總結(jié)了細(xì)菌β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)最適pH為6.0～8.0。以磷酸鹽緩沖液控制反應(yīng)體系pH，考察pH對(duì)低聚半乳糖合成的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：S62β-半乳糖苷酶在pH 6.0～8.0穩(wěn)定性較好，表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)糖基作用，低聚半乳糖產(chǎn)率為26%～30%，乳糖轉(zhuǎn)化率為69%～75%，其中在pH為7.0時(shí)，有最大低聚半乳糖產(chǎn)率(29.46±0.66)%，乳糖消耗率為(73.40±0.85)%。因此，在此反應(yīng)體系中，最適pH為7.0。

2.3 底物濃度對(duì)低聚半乳糖合成的影響

在乳糖存在時(shí)，β-半乳糖苷酶存在著水解活性與轉(zhuǎn)糖基化活性相互競爭現(xiàn)象，即當(dāng)反應(yīng)開始時(shí)，乳糖濃度較高，轉(zhuǎn)糖基作用占主導(dǎo)作用，但是隨著反應(yīng)進(jìn)行，水解活性逐漸增強(qiáng)，最終生成葡萄糖和半乳糖[28]。由此可見高濃度的乳糖有利于低聚半乳糖的合成。因此，選擇150～350 g/L的乳糖，研究其對(duì)低聚半乳糖合成的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度大于200 g/L時(shí)，乳糖轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度的增加逐漸降低，其原因主要是在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，底物過飽和，酶結(jié)合底物能力有限，進(jìn)而轉(zhuǎn)化率下降；而底物質(zhì)量濃度為150 g/L時(shí)，底物濃度降低，酶水解活性增強(qiáng)，導(dǎo)致乳糖和低聚半乳糖被降解為葡萄糖和半乳糖。所以當(dāng)酶量為30 U/mL，反應(yīng)時(shí)間為6 h，底物質(zhì)量濃度為200 g/L，其低聚半乳糖產(chǎn)率為(26.57±0.36)%，乳糖消耗率最高為(67.40±0.55)%。

2.4 溫度對(duì)低聚半乳糖合成的影響

低溫酶在低溫條件下通常保留著較高的酶活。Fan等[29]等研究了來自Rahnellasp. R3的低溫β-半乳糖苷酶，以乳糖為底物，在4～35 ℃的寬溫度范圍內(nèi)顯示高活性；Coker[30]報(bào)道了AntarcticArthrobacterβ-半乳糖苷酶以乳糖為底物時(shí)最適為15～20 ℃。筆者研究了溫度對(duì)低聚半乳糖合成的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：乳糖存在時(shí)，S62β-半乳糖苷酶同樣在25～45 ℃時(shí)，表現(xiàn)出較高的酶活，最適轉(zhuǎn)糖基化溫度為40 ℃，此時(shí)低聚半乳糖產(chǎn)率為(36.15±0.01)%，乳糖消耗率為(82.45±0.01)%。溫度過高時(shí)，S62β-半乳糖苷酶在較短的時(shí)間內(nèi)失活，導(dǎo)致溫度為45 ℃時(shí)的酶活比40 ℃時(shí)的酶活下降明顯。

圖2 pH對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.2 Effects of pH on GOS synthesis

圖3 乳糖濃度對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.3 Effects of lactose concentration on GOS synthesis

圖4 溫度對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.4 Effects of temperature on GOS synthesis

2.5 加酶量對(duì)低聚半乳糖合成的影響

在酶催化過程中為了保證底物高效利用以及產(chǎn)物高得率，酶用量適當(dāng)是關(guān)鍵因素。S62β-半乳糖苷酶加酶量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知：當(dāng)加酶量為15 U/mL時(shí)，加酶量低，轉(zhuǎn)化效率不高，乳糖消耗率和低聚半乳糖產(chǎn)率都最低；當(dāng)加酶量為75 U/mL時(shí)，加酶量高，在6 h內(nèi)反應(yīng)速度過快，乳糖消耗率最高，但低聚半乳糖產(chǎn)率降低，此時(shí)低聚半乳糖更多的被降解。所以在此反應(yīng)體系中，S62β-半乳糖苷酶最適加酶量為60 U/mL，此時(shí)乳糖消耗率為(82.51±0.79)%，GOS轉(zhuǎn)化率為(33.88±0.01)%。

圖5 加酶量對(duì)低聚半乳糖合成的影響Fig.5 Effects of enzyme amount on GOS synthesis

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚半乳糖合成的影響

β-半乳糖苷酶反應(yīng)工藝中要求的是高效高產(chǎn)低耗，所以反應(yīng)時(shí)間的控制有利于提高工藝效率。S62β-半乳糖苷酶的反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知：乳糖消耗率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，但低聚半乳糖產(chǎn)率先增加后降低，在反應(yīng)時(shí)間為10 h時(shí)，低聚半乳糖產(chǎn)率達(dá)到最大值，為(33.1±0.32)%，乳糖消耗率為(77.87±0.28)%。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)低聚糖合成的影響Fig.6 Effects of time on the GOS synthesis

2.7 低聚半乳糖合成正交試驗(yàn)

在以上的單因素條件基礎(chǔ)上，設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為4 h，以底物濃度、反應(yīng)溫度、加酶量、pH為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)果分析如表3和表4所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表4 結(jié)果分析表

由表2～4可知：最適反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度40 ℃、底物質(zhì)量濃度300 g/L、反應(yīng)pH 7.0、加酶量50 U/mL，得到最高低聚半乳糖產(chǎn)率為(37.87±0.11)%，此時(shí)乳糖消耗率為(75.90±0.43)%。不同因素對(duì)低聚半乳糖產(chǎn)率的影響順序從大到小依次為底物濃度、加酶量、pH、溫度。

2.8 低聚半乳糖合成最適條件

在上述正交試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)反應(yīng)體系下，每隔1 h取樣1次，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知：低聚半乳糖產(chǎn)率和乳糖降解率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增加，在4～8 h內(nèi)，低聚半乳糖產(chǎn)率都維持在40%，在反應(yīng)6 h時(shí)可獲得最大低聚半乳糖產(chǎn)率(41.91±0.27)%，乳糖消耗率為(82.47±0.38)%。

目前，大部分β-半乳糖苷酶用于合成低聚半乳糖時(shí)，乳糖的高效利用率和低聚半乳糖高產(chǎn)率無法兼得。Aburto等[11]對(duì)米曲霉β-半乳糖苷酶進(jìn)行了研究，在其最優(yōu)反應(yīng)體系中，低聚半乳糖產(chǎn)率為40%，40.3%的乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)化，但其乳糖利用率不高。Geiger等[31]報(bào)道了嗜熱鏈球菌β-半乳糖苷酶在37 ℃、80%乳糖轉(zhuǎn)化時(shí)，低聚半乳糖產(chǎn)率達(dá)到總糖含量的34.2%；在94%～95%的乳糖轉(zhuǎn)化率下，低聚半乳糖產(chǎn)率降低至30%，乳糖利用率高，但低聚半乳糖產(chǎn)率低。Vasiljevic等[32]報(bào)道了保加利亞乳桿菌的β-半乳糖苷酶以質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的乳糖為底物，在50 ℃下獲得最佳的低聚半乳糖產(chǎn)量，為20%。而本研究中的S62β-半乳糖苷酶在乳糖轉(zhuǎn)化率接近90%時(shí)，反應(yīng)4～6 h時(shí)，低聚半乳糖產(chǎn)率始終可保持40%以上，所以S62β-半乳糖苷酶可以在較長的時(shí)間內(nèi)維持高低聚半乳糖產(chǎn)量。

對(duì)40 ℃下S62β-半乳糖苷酶剩余酶活進(jìn)行檢測，8 h時(shí)酶活僅剩60%左右。由于S62β-半乳糖苷酶屬于低溫酶，溫度高時(shí)，酶的半衰期短，后期酶活降低，減慢了低聚半乳糖的水解，這也可能是低聚半乳糖產(chǎn)率在長時(shí)間內(nèi)維持在40%以上的原因之一。

圖7 最適條件反應(yīng)結(jié)果及剩余酶活變化Fig.7 Optimum reaction conditions and the remaining changes of enzyme activity

3 結(jié)論

筆者對(duì)S62β-半乳糖苷酶產(chǎn)低聚半乳糖工藝進(jìn)行了研究，反應(yīng)體系為1.9 mL反應(yīng)液，0.1 mL酶液，得到最適產(chǎn)低聚半乳糖條件如下：反應(yīng)溫度40 ℃、底物質(zhì)量濃度300 g/L、反應(yīng)pH 7.0、加酶量50 U/mL，反應(yīng)6 h時(shí)可獲得最大低聚半乳糖產(chǎn)率(41.91±0.27)%，此時(shí)乳糖消耗率為(82.47±0.38)%。反應(yīng)4～8 h內(nèi)，低聚半乳糖產(chǎn)率均維持在40%以上。而在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)乳糖轉(zhuǎn)化率接近90%時(shí)，低聚半乳糖產(chǎn)率仍可維持在40%左右，即乳糖轉(zhuǎn)化率與低聚半乳糖產(chǎn)率均可維持在較高水平，不僅獲得了高附加值的產(chǎn)物，也在一定程度上提高了原料的利用率，這可為后續(xù)的S62β-半乳糖苷酶工藝應(yīng)用提供技術(shù)參考，同時(shí)也有利于低聚半乳糖的工業(yè)化生產(chǎn)。