模擬氮沉降對常綠闊葉林6種植物氮同化的影響

吳淑華 ，王佳新 ，張世柯 ，王俊，曾陽金，李遠球，劉楠*

1. 廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點實驗室/中國科學(xué)院華南植物園，廣東 廣州 510650；2. 廣東石門臺國家級自然保護區(qū)管理局，廣東 英德 513000；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

大氣氮沉降是一個復(fù)雜耦合的過程，指含氮化合物由地表的排放源排放到大氣中，在大氣中經(jīng)過混合、擴散、轉(zhuǎn)化和漂移，直到從大氣中移除后重新返回地表（或植物冠層）的過程（Goulding，1990）。大氣氮沉降有干沉降和濕沉降兩種形式，干沉降主要包括NO、N2O和NH3等氣態(tài)含氮化合物，濕沉降則主要包括NO3-和NH4+（Wedin et al.，1996）。自 20世紀中期以來，大量燃燒化石燃料，生產(chǎn)和使用含氮肥料，以及集約化畜牧業(yè)發(fā)展迅速，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大氣氮沉降速率急劇增加（Galloway et al.，2008；Liu et al.，2013；寧應(yīng)之等，2018）。中國已發(fā)展成為世界第三大氮沉降地區(qū)（僅次于歐洲和北美），隨著工業(yè)化和城鎮(zhèn)化的發(fā)展，氮沉降還在繼續(xù)增加（Liu et al.，2011；Jia et al.，2014；Zhan et al.，2014）。氮沉降加劇嚴重影響森林生態(tài)系統(tǒng)的健康（Isbell et al.，2011；Chen et al.，2013），對陸地生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一系列生態(tài)風(fēng)險，如土壤酸化（Lu et al.，2014）、生物多樣性喪失（Sala et al.，2000；Bobbink et al.，2010；Porter et al.，2013；Simkin et al.，2016a；Simkin et al.，2016b）、植物生產(chǎn)力降低（Isbell et al.，2013；Yu et al.，2016）、森林植物氮素分配失調(diào)等。

大氣圈中含量最豐富的元素為氮素，它是植物生長所需的大量元素，被稱之為生命元素（Cook，2015）。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是植物可直接吸收和利用的2種有效態(tài)氮源。氮素同化途徑主要包括NR/NiR途徑和GS/GOGAT途徑。首先，硝酸還原酶（NR）將 NO3-還原為 NO2-，亞硝酸還原酶（NiR）又將NO2-還原為 NH4+（Miller et al.，2005）。隨后 NH4+在谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）的催化下進一步被合成谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）（Lea et al.，1998）。合成后的氨基酸進一步轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、葉綠素、維生素、核酸、各種細胞器膜組分及細胞壁物質(zhì)（Kusano et al.，2011）。顯然，外源單輸入（如氮沉降）會對森林植物上述氮同化過程產(chǎn)生直接影響。

氮沉降已被視為全球性問題，氮沉降對森林生態(tài)系統(tǒng)的影響及其機理的研究也成為全球研究熱點，目前國際上有關(guān)溫帶地區(qū)氮沉降對森林生態(tài)系統(tǒng)影響的研究較多，且大多集中在含氮化合物、光合產(chǎn)物和生物量的觀測（Vitousek，1994；Chapin et al.，2000；Sala et al.，2000；Edison et al.，2015），而還未就氮沉降對亞熱帶常綠闊葉林優(yōu)勢植物氮代謝的干擾過程和機理進行分析。亞熱帶是中國社會、經(jīng)濟和文化的重要區(qū)域，在這一區(qū)域開展氮沉降對常綠闊葉林優(yōu)勢森林植物氮同化的影響的研究十分迫切且有重要意義。

1 研究樣地概況、材料及方法

1.1 研究樣地概況

本研究依托中國科學(xué)院華南植物園在廣東石門臺國家級自然保護區(qū)（東經(jīng) 113°05′－113°31′，北緯 24°22′－24°31′）建成的林冠模擬氮沉降野外控制試驗平臺（Canopy Addition of Nitrogen，CAN），通過林冠及林下模擬施氮處理（定量噴施NH4NO3溶液），闡明大氣氮沉降增加對森林生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的影響。

石門臺國家級自然保護區(qū)是廣東省面積最大（33555 hm2）、植被保存較好的森林生態(tài)系統(tǒng)自然保護區(qū)。該區(qū)屬南亞熱帶季風(fēng)型氣候，具有南亞熱帶常綠闊葉林的典型性和過渡性、珍稀性和自然性，對區(qū)域生態(tài)環(huán)境有重大影響。年均溫為20.8 ℃，平均降雨量超過2000 mm。保護區(qū)內(nèi)常綠闊葉林林齡約50年，冠層高度約26 m，林冠郁閉度約92%，喬木層、林下灌木和草本植物種類豐富。保護區(qū)的主要植被是天然的次生常綠闊葉林，森林植被以熱帶亞熱帶的代表性科屬為主，優(yōu)勢科包括殼斗科（Fagaceae）、山茶科（Theaceae）、樟科（Lauraceae）、杜英科（Elaeocarpaceae）、木蘭科（Magnoliaceae）、鼠刺科（Escalloniaceae）、交讓木科（Daphniphyllaceae）、金縷梅科（Hamamelidaceae）、冬青科（Aquifoliaceae）、安息香科（Styracaceae）、杜鵑花科（Ericaceae）及梧桐科（Sterculiaceae）等。該群落的優(yōu)勢種與優(yōu)勢科相適應(yīng)，基本上為殼斗科、山茶科、樟科、杜英科等熱帶亞熱帶成分的種類，這些優(yōu)勢種類主導(dǎo)著石門臺自然保護區(qū)的森林群落類型與結(jié)構(gòu)。

1.2 實驗設(shè)計

林冠模擬氮沉降野外控制試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，樣地的設(shè)置綜合考慮了植被、坡向和坡度等多種因素，包含4個區(qū)組（4個Block代表4個重復(fù)），每個區(qū)組隨機設(shè)置5個樣方，對應(yīng)5種不同處理，共20個樣方。樣方為半徑17 m的圓形，為防止處理間的干擾，各樣方之間留有約20 m的緩沖帶，中間加裝深度為1 m的PVC隔離板（圖1）。每個圓形樣方中心有一座35 m高三角形鐵塔，一共8座，用于支撐變頻調(diào)速恒壓噴灌設(shè)備噴灑處理溶液（NH4NO3溶液）。實驗樣地于2012年10月建成，經(jīng)全面調(diào)試以后，于2013年4月啟動實驗處理，處理時間為每年的4－10月（植物生長季），每年共噴灑7次。實驗處理包括：林冠施氮CN25（N 25 kg·hm-2·a-1）、林冠施氮 CN50（N 50 kg·hm-2·a-1）、林下施氮 UN25（N 25 kg·hm-2·a-1）和林下施氮 UN50（N 50 kg·hm-2·a-1）。對照樣方（CT），不噴施N溶液，但噴施相應(yīng)的水量。

1.3 實驗對象

根據(jù)該實驗樣地生物多樣性調(diào)查數(shù)據(jù)，分析每個群落中所有植物的重要值，以重要值占前80%的物種為優(yōu)勢物種。

植物具有多種獲取氮的途徑：土壤N的吸收、大氣N2的固定、干濕沉降N的吸收等（趙平等，1998）。因此，植物可以通過根吸收土壤中的銨鹽（NH4+）和硝酸鹽（NO3-）及部分有機氮（Killham，1994）。同時，也可以通過冠層葉片吸收氣態(tài)氮污染物及濕沉降中的氮，可達到全部氮來源的10%－30%（Krupa，2003）。由于本研究平臺分別通過林冠噴施（首先接觸大喬木的冠層葉片）及林下噴施（主要作用于土壤表層）外源NH4NO3模擬氮沉降，決定了不同層級森林優(yōu)勢樹種對外源氮素的主要吸收途徑（冠層葉片和根部）。因此，本研究選取了在各個樣方中皆有分布的6種優(yōu)勢樹種（表1）作為研究對象，包括3個大喬木樹種（錐栗Castanea henryi、荷木 Schima superba、鴨腳木 Schefflera octophflla）和 3個小喬木/灌木樹種（羅傘 Ardisia quinquegona、柏拉木Blastus cochinchinensis、粗葉木Lasianthus chinensis）。

1.4 樣品采集

生長季末，全年氮噴施結(jié)束后，于2016年10月進行樣品采集。每個樣方采集每種植物 3－6株成熟植物的當(dāng)年生葉片，將采集的葉片放置于裝有吸水紙巾的密封袋中，將密封袋放置于裝有冰袋的密封箱中帶回實驗室。稱質(zhì)量分裝后放在-80 ℃超低溫冰箱中保存以待測定硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量以及氮同化相關(guān)酶活性。

1.5 硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的測定

圖1 石門臺樣地分布Fig. 1 plot distribution map of Shimentai

表1 研究對象Tabe 1 Research object

稱取待測植物葉片0.1 g，放入2 mL離心管中，加入1 mL純水，室溫勻漿后，置于90 ℃恒溫搖床中振蕩30 min。待其冷卻后，于12000 g下離心15 min（25 ℃），用移液槍吸取上清液進行硝態(tài)氮測定。在濃酸條件下，NO3-可與水楊酸發(fā)生反應(yīng)，生成硝基水楊酸。硝基水楊酸在堿性條件下（pH＞12）呈黃色，在一定的范圍內(nèi)，其顏色深淺與濃度成正比，故采用比色法測定硝態(tài)氮含量（張智良，2003）48。

稱取待測植物葉片0.1 g，放入2 mL離心管中，加入1 mL提取液，室溫勻漿后，于12000 g下離心15 min（25 ℃），用移液槍吸取上清進行測定。α-氨基酸與水合茚三酮溶液一起加熱，經(jīng)氧化脫氨后變成α-酮酸，酮酸進一步脫羧變成醛，水合茚三酮則被還原。在弱酸環(huán)境中，還原型茚三酮，氨與另一分子水合茚三酮反應(yīng)，縮合生成藍紫色物質(zhì)，在580 nm處有吸收峰，從而測定銨態(tài)氮含量（張智良，2003）49。

1.6 氮同化相關(guān)酶活性的測定

NR活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、8000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。NR可將NO3-還原成NO2-，在一定條件下，NO2-的生成量與 NR的活性呈正相關(guān)，因此以NO2-的生成量代表NR活性。在酸性溶液中，NO2-與磺胺形成重氮鹽，重氮鹽再與 α-萘胺偶聯(lián)，形成紫紅色的偶氮化合物，該偶氮化合物在540 nm有最大吸收峰，用分光光度計進行測定。酶活性定義：每小時每克鮮質(zhì)量樣品中催化產(chǎn)生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位（高俊鳳，2006）61-62。

NiR活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、10000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。NiR可將 NO2-還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2-減少，即540 nm處吸光值的變化可反映葉片中NiR的活性。酶活性定義：每小時每克鮮質(zhì)量樣品還原1 μmol NO2-的量為1個酶活力單位（高俊鳳，2006）63。

GS活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、8000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。谷氨酰胺在ATP和Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進一步轉(zhuǎn)化為γ-谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下與鐵形成紅色的絡(luò)合物；該絡(luò)合物在 540 nm處有最大吸收峰，可用分光光度計測定。酶活性定義：每克鮮質(zhì)量樣品在1 mL反應(yīng)體系中每分鐘使540 nm下吸光值變化0.01定義為一個酶活力單位（高俊鳳，2006）64。

GOGAT活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、8000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時NADH氧化生成NAD+，340 nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。酶活性定義：每克鮮質(zhì)量樣品每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為1個酶活力單位（高俊鳳，2006）65。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運用GraphPad Prism 7.00進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗林冠噴氮或林下噴氮濃度梯度為0、25和50 kg·hm2·a-1對植物葉片硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量及NR、NiR、GS、GOGA酶活性的影響。P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果

2.1 硝態(tài)氮和銨態(tài)氮

不同氮添加處理下，粗葉木、鴨腳木和荷木的硝態(tài)氮含量皆低于 500 μg·g-1，而柏拉木、羅傘和錐栗的硝態(tài)氮含量高達1000 μg·g-1，并且都呈現(xiàn)出顯著性差異。在CN50和UN50處理下，柏拉木和羅傘的硝態(tài)氮含量較 CT顯著降低，而 CN25和UN25無顯著性差異。在林冠噴氮（CN25和CN50）和林下施氮（UN25和UN50）處理下，錐栗的硝態(tài)氮含量顯著升高（圖2A和圖2B）。不同氮添加處理下，柏拉木葉片銨態(tài)氮含量最高，達250 μg·g-1，羅傘次之，其葉片銨態(tài)氮含量為 100 μg·g-1。粗葉木、錐栗、鴨腳木和荷木4種植物葉片銨態(tài)氮含量均低于 100 μg·g-1。在林冠（CN25 和 CN50）和林下（UN25和UN50）氮添加處理下，柏拉木的銨態(tài)氮含量均較CT顯著升高（圖2C和圖2D）。

圖2 氮添加處理對6種植物葉片硝態(tài)氮（A和B）和銨態(tài)氮（C和D）的影響Fig. 2 Nitrate nitrogen content (A and B) and Ammonium nitrogen content (C and D) of six plant leaves as affected by nitrogen addition

2.2 氮同化相關(guān)酶活性

粗葉木和羅傘的NR活性約為1 μg·g-1，其余4種植物較低。柏拉木、錐栗、鴨腳木和荷木的 NR活性約為2 μg·g-1（圖3A、圖3B）。柏拉木的NiR活性最低，約2 μg·g-1。其余5種植物的NiR活性約為6 μg·g-1（圖3A、圖3B）。在CN50處理下，粗葉木和羅傘的NR活性顯著降低，錐栗的NR活性顯著升高。在CN25處理下，柏拉木的NR活性顯著升高（圖3A）。在UN50處理下，柏拉木和錐栗的的NR活性顯著升高（圖3B）。柏拉木較葉片的NiR活性低于其他5種植物。在CN50處理下，粗葉木和柏拉木的 NiR活性顯著升高，而荷木的NiR活性顯著降低（圖3C）。在UN25處理下，粗葉木的NiR活性顯著升高，而羅傘的NiR活性顯著降低。在UN50處理下，錐栗的NiR活性顯著降低（圖3D）。

圖3 氮添加處理對6種植物葉片硝酸還原酶（A和B）和亞硝酸還原酶（C和D）活性的影響Fig. 3 NR activity (A and B) and NiR activity (C and D) of six plant leaves as affected by nitrogen addition

6種植物的GS活性大致相同，其中粗葉木葉片GS活性最高，約為25 μg·g-1（圖4A、圖4B）。粗葉木、羅傘、錐栗、鴨腳木和荷木的GOGAT活性都低于 500 μg·g-1，而柏拉木 GOGAT活性高達1500 μg·g-1（圖 3C、圖 3D）。在 CN50 處理下，柏拉木葉片的 GS活性較CT顯著降低。在 CN25處理下，荷木的GS活性較CT顯著降低（圖4A）。林下氮添加處理（UN25和 UN50）對 6種植物的GS活性無顯著性影響（圖4A）。在林冠氮添加處理（CN25和CN50）下，羅傘和錐栗的GOGAT活性顯著升高（圖4C）。在CN50處理下，羅傘和鴨腳木的GOGAT活性顯著升高。在林下氮添加處理（UN25和UN50）下，錐栗的GOGAT活性顯著升高（圖4D）。

3 討論

3.1 葉片中的硝態(tài)氮含量、NR活性和NiR活性對模擬氮沉降的響應(yīng)

圖4 氮添加處理對6種植物葉片谷氨酰胺合成酶（A和B）和谷氨酸合酶（C和D）活性的影響Fig 4. GS activity (A and B) and GOGAT activity (C and D) of six plant leaves as affected by nitrogen addition

植物中的氮主要以有機氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮組成。其中，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是植物可直接吸收和利用的兩種有效態(tài)的氮源（喬楓等，2018）。硝態(tài)氮在植物體內(nèi)必須經(jīng)NR作用還原為銨態(tài)氮后才能被吸收和利用（Marschner，2001）。當(dāng)植物對硝態(tài)氮的吸收超過了其還原能力，致使進入植物體內(nèi)的硝態(tài)氮不能及時被還原轉(zhuǎn)化而出現(xiàn)大量累積。積累在植物體內(nèi)的硝態(tài)氮，其中一大部分儲存于液泡中，小部分存在于細胞質(zhì)中。一般認為，液泡是硝態(tài)氮的儲存庫，細胞質(zhì)則是硝態(tài)氮的代謝庫（許長藹等，1990）。NR和NiR對初級氮同化的控制起著十分重要的作用，并顯著影響植物的生長發(fā)育（H?nsch et al.，2001）。NR和NiR皆為誘導(dǎo)酶，NR活性主要受底物NO3-誘導(dǎo)，NiR活性主要受底物NO2-誘導(dǎo)，但同時也受光照溫度等多種因素的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在CN50和UN50處理下，柏拉木大量吸收硝態(tài)氮，從而誘導(dǎo)了NR活性升高，進而還原更多的硝態(tài)氮，導(dǎo)致其葉片硝態(tài)氮含量顯著降低。但在CN25和UN25處理下，柏拉木的硝態(tài)氮則較少出現(xiàn)顯著性變化。一般認為，25 kg·hm2·a-1施氮量為氮沉降的臨界負荷值（Ye et al.，2018），過量的氮添加導(dǎo)致氮素流失，進一步導(dǎo)致群落植被組成發(fā)生變化（Vitousek，1994）。錐栗葉片中的硝態(tài)氮含量隨著氮添加濃度的增加而呈梯度顯著升高，這可能說明錐栗可最大限度地吸收硝態(tài)氮，NR活性雖在氮添加處理中顯著增加，但NiR并無顯著變化，硝態(tài)氮還原為銨的過程可能受阻。植物體內(nèi)積累過多的 NO2-會影響植物的生長發(fā)育（Yamasaki，2000），因而氮沉降有可能會導(dǎo)致該物種的生長受到一定程度的抑制（Clark et al.，2013）。

3.2 葉片中的銨態(tài)氮含量、GS活性和GOGAT活性對模擬氮沉降的響應(yīng)

雖然銨態(tài)氮和硝態(tài)氮都是植物的氮源，但在兩種氮源可選擇的情況下，不同植物對它們的相對吸收量存在著明顯差異（周碧青等，2017）。這種差異受植物的種類、生育期、土壤溶液pH、2種氮源的濃度等多種因素的影響（Vitousek et al.，1986）。NH4+基本上不能以 NH4+形式被運輸?shù)饺~片中，絕大部分在根部被同化，因而對葉片同化氨的酶的促進作用相對小一些。銨態(tài)氮的同化由 GS/GOGAT途徑完成，該過程不僅消耗大量ATP，而且消耗大量的碳（Bao et al.，2014）。當(dāng)銨態(tài)氮進入體內(nèi)后，不能大量貯存，一旦超過其忍受量，便可導(dǎo)致葉片出現(xiàn)斑點、黃化等氨中毒現(xiàn)象（王宇通等，2010）。本研究發(fā)現(xiàn)，柏拉木CN50、UN50氮添加處理下，其葉內(nèi)銨態(tài)氮含量顯著升高而大量積累。本研究也發(fā)現(xiàn)，在氮添加處理下，柏拉木的葉片確實存在斑點、黃化現(xiàn)象。GS同NR一樣，也是一種誘導(dǎo)酶，然而經(jīng)銨態(tài)氮誘導(dǎo)（Miflin et al.，1980），GS活性未增反降，有研究表明，氮素水平過高時GS活性反而會下降（張智猛等，2008）；GOGAT活性無顯著變化，可能原因是即使NH4+被GS同化為谷氨酰胺，但由于細胞內(nèi)分隔等原因使其不能有效地成

為GOGAT的底物（鄭朝峰，1986）。本研究結(jié)果顯示，氮添加處理下，羅傘、錐栗和鴨腳木GS活性無顯著性變化，而GOGAT活性卻顯著增加，這可能是由于氮添加處理導(dǎo)致了氮同化水平的紊亂（Bao et al.，2014）。

4 結(jié)論

氮沉降影響常綠闊葉林優(yōu)勢植物葉片的氮代謝過程及氮同化關(guān)鍵酶活性，進而導(dǎo)致植物的生長發(fā)生變化。從氮代謝相關(guān)指標(biāo)來看，氮沉降促進大喬木生長，抑制小喬木/灌木生長。亞熱帶常綠闊葉林優(yōu)勢種類皆具有一定的抵抗氮沉降能力，但不同類型植物對氮沉降有著不同的響應(yīng)和忍耐范圍，當(dāng)超出一定的范圍則會影響植物的生長，對其群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生潛在的影響。