真菌Penicillium novae-zeelandiae HSD07B發(fā)酵產(chǎn)紅色素研究

孫 瑞，段佩玲

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451460)

色素主要有人工合成色素和天然色素，他們被廣泛應(yīng)用于化妝品工業(yè)、醫(yī)藥保健工業(yè)、食品工業(yè)、日用品工業(yè)等領(lǐng)域。長(zhǎng)期使用合成色素易帶來一系列問題，如可能的致癌、致畸、慢性中毒等，使得人們逐漸意識(shí)到合成色素的危害性。隨著食品安全的社會(huì)需求越來越迫切，以天然色素代替合成色素成為必然趨勢(shì)。

天然色素的來源極其豐富，一般可分四大類：礦物質(zhì)色素、植物色素、動(dòng)物色素、微生物色素。天然色素不僅具有著色效果，大部分色素還有一定的生理功能，如：番茄紅素對(duì)心血管病和癌癥等慢性疾病有一定緩解作用；姜黃素具有抗炎、抗感染、抗凝等多種藥用生理功能。相對(duì)于合成色素的快速合成，從植物、動(dòng)物等組織提取色素品種有限、工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，這些問題限制了天然色素的大量生產(chǎn)。微生物培養(yǎng)技術(shù)成熟、培養(yǎng)條件可控，為大規(guī)模生產(chǎn)色素提供了基礎(chǔ)條件。目前，研究人員利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然色素的技術(shù)和工藝越發(fā)成熟，通過各種手段優(yōu)化發(fā)酵工藝，得到了如類胡蘿卜素、紅曲色素等多種天然色素。未來利用微生物發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)天然色素將成為生產(chǎn)天然色素的主力。

在前期研究中，成功實(shí)現(xiàn)了酵母屬假絲酵母(Candida sp.)和青霉(Penicillium novae-zeelandiae HSD07B)兩種微生物混合發(fā)酵產(chǎn)生紅色素。由于兩種微生物混合發(fā)酵的技術(shù)工藝操作流程煩瑣，致使該模式產(chǎn)色素的成本過高。本研究主要探索青霉發(fā)酵產(chǎn)紅色素的能力和發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

所用的菌種為青霉，該菌株由河南師范大學(xué)功能微生物綠色轉(zhuǎn)化技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室分離并保存。菌株保存和培養(yǎng)用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，pH自然，使用前115 ℃滅菌30 min。

1.2 紅色素濃度的測(cè)定

紅色素濃度采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，方法步驟如下：

研究表明紅色素在495 nm處有最大吸收峰，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)得到的紅色素進(jìn)行一系列梯度稀釋，蒸餾水為對(duì)照，用UV2600紫外分光光度計(jì)測(cè)定各稀釋濃度紅色素的吸光度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為吸光度，縱坐標(biāo)為紅色素濃度。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行過濾、離心、稀釋之后用紫外分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線取值，乘以稀釋倍數(shù)得到發(fā)酵液紅色素產(chǎn)量。

1.3 分生孢子懸液制備

取4 mL已滅菌的無菌水移入PDA斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株試管中，將接種環(huán)在酒精燈上灼燒片刻，冷卻，置于試管中輕輕刮取斜面上生長(zhǎng)的孢子，使孢子懸浮于注入的無菌水中，再將該混合液倒入盛有無菌水的三角瓶中，孢子懸液制備完成，待用。

1.4 培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)紅色素產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度的影響：根據(jù)真菌正常生長(zhǎng)的溫度范圍，本研究設(shè)置了18 ℃、24 ℃、30 ℃、36 ℃、42 ℃ 5個(gè)溫度梯度探究溫度對(duì)產(chǎn)紅色素量的影響。

接種量的影響：分別取0.4 mL、0.7 mL、1 mL、1.3 mL、1.6 mL孢子懸液濃度為107 個(gè)/mL的培養(yǎng)物至300 mL新鮮培養(yǎng)基中。

pH酸堿度的影響：液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH用HCl分別調(diào)成5個(gè)pH酸堿度梯度，分別為2.0、4.0、6.0、8.0和10.0。將配置好的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝到容積為500 mL的錐形瓶中，每瓶裝300 mL，封裝后高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。

培養(yǎng)方式的影響：30 ℃的恒溫靜置培養(yǎng)；30 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)；發(fā)酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后，再30 ℃的恒溫靜置培養(yǎng)。

培養(yǎng)時(shí)間的影響：發(fā)酵瓶30 ℃、160 r/min恒溫振蕩分別培養(yǎng)35 h、38 h、41 h、44 h、47 h，然后置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

用紫外分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)495 nm處測(cè)定吸光度，讀取各數(shù)值后，繪制曲線，見圖1，曲線回歸方程為y=1.305x-0.0305(R2=0.9962)，這表明在一定濃度范圍內(nèi)紅色素在波長(zhǎng)495 nm處呈顯著的線性相關(guān)。

圖1 OD值與紅色素濃度的線性關(guān)系

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)紅色素的影響

溫度對(duì)產(chǎn)紅色素的影響見圖2，在溫度為18 ℃～30 ℃之間，色素的產(chǎn)量隨溫度上升而上升，在30 ℃～42 ℃之間與溫度呈負(fù)相關(guān)，故30 ℃是產(chǎn)紅色素的最佳發(fā)酵溫度，產(chǎn)量達(dá)到1.48 mg/mL。

圖2 溫度對(duì)產(chǎn)紅色素的影響

2.3 接種量對(duì)產(chǎn)紅色素的影響

菌株的生長(zhǎng)和代謝能力受很多因素的影響，其中接種量是決定因素之一。本研究設(shè)置5個(gè)孢子懸液接種量探討菌種接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)紅色素的影響，接種的分生孢子懸液濃度均為1.5×107個(gè)/mL，結(jié)果見圖3。接種量為0.4 mL到1 mL之間時(shí)產(chǎn)紅色素量逐漸增加，之后隨著接種量增加紅色素產(chǎn)量減少，增加接種量并不能提高產(chǎn)量，故1mL是產(chǎn)紅色素的最佳接種量。

圖3 接種量對(duì)紅色素產(chǎn)量的影響

2.4 pH酸堿度對(duì)產(chǎn)紅色素的影響

在最適溫度和接種量條件下，繼續(xù)對(duì)培養(yǎng)初始pH酸堿度對(duì)產(chǎn)紅色素的影響進(jìn)行研究，結(jié)果見圖4，在pH酸堿度為2.0到6.0之間時(shí)隨初始pH酸堿度增加，紅色素產(chǎn)量增加，而后紅色素產(chǎn)量與初始pH酸堿度負(fù)相關(guān)，故pH酸堿度為6.0左右為最佳發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)紅色素的初始pH酸堿度，過酸或過堿的環(huán)境均不利于發(fā)酵產(chǎn)紅色素。

圖4 初始pH對(duì)產(chǎn)生紅色素的影響

2.5 培養(yǎng)方式的影響

微生物最適宜生長(zhǎng)和最適宜代謝條件除了溫度、pH等外，發(fā)酵培養(yǎng)方式對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大影響。本研究考察了靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)及兩者結(jié)合培養(yǎng)的方式對(duì)紅色素產(chǎn)生的影響，結(jié)果見表1。第1組發(fā)酵瓶置于30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)箱培養(yǎng)；第2組發(fā)酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時(shí)間，再將其置于30 ℃的恒溫靜置培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時(shí)間；第3組發(fā)酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。三種操作發(fā)酵時(shí)間相同。結(jié)果表明，第2組的分段發(fā)酵方式最利于產(chǎn)紅色素。

表1 不同發(fā)酵培養(yǎng)方式對(duì)紅色素產(chǎn)生的影響

2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)紅色素的影響

前期實(shí)驗(yàn)表明振蕩培養(yǎng)明顯有利于真菌快速生長(zhǎng)，但持續(xù)的振蕩培養(yǎng)并不能增加紅色素產(chǎn)量。因此，進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵振蕩時(shí)間對(duì)產(chǎn)紅色素的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖5，在振蕩時(shí)間為35 h到41 h之間時(shí)隨振蕩培養(yǎng)時(shí)間增加，紅色素產(chǎn)量也增加，而后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)紅色素產(chǎn)量出現(xiàn)下降，這表明紅色素的產(chǎn)生和菌體生長(zhǎng)并非同步。

圖 5 振蕩時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)紅色素的影響

3 討論

本研究對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)青霉菌株發(fā)酵產(chǎn)紅色素的條件行實(shí)驗(yàn)，考察裝量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件等參數(shù)對(duì)紅色素產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：500 mL錐形瓶中裝入300 mL初始pH酸堿度為6.0的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種濃度為1.5×107個(gè)/mL分生孢子懸液1 mL，發(fā)酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)41 h，再將其置于30 ℃的恒溫靜置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間，產(chǎn)紅色素量最高。