苯甲磺酰截短側(cè)耳素國家對照品的研制

韓寧寧，戴青，趙暉，楊秀玉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

延胡索酸泰妙菌素是截短側(cè)耳素類半合成的動物專用抗生素。苯甲磺酰截短側(cè)耳素是合成延胡索酸泰妙菌素的中間體?！吨袊F藥典》2015年版一部收載了延胡索酸泰妙菌素及其可溶性粉與預混劑[1]。在原料及制劑的含量測定過程中，均需將延胡索酸泰妙菌素對照品與苯甲磺酰截短側(cè)耳素對照品混合配制為系統(tǒng)適用性對照品溶液以測定系統(tǒng)適用性。

經(jīng)查詢，目前僅USP有該對照品供應，但價格昂貴，購買周期長。國家獸藥基礎(chǔ)信息查詢系統(tǒng)[2]顯示，目前泰妙菌素及其制劑的有效期內(nèi)批準文號共600個，其中原料文號10個，預混劑文號293個，可溶性粉文號297個。如此眾多的企業(yè)在泰妙菌素含量測定過程中均需使用苯甲磺酰截短側(cè)耳素對照品進行系統(tǒng)適用性檢查。然而，調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量控制過程中，多使用自行生產(chǎn)的苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料充當系統(tǒng)適用性工作對照品，該原料無相應質(zhì)量標準對其純度進行控制。因此，研制苯甲磺酰截短側(cè)耳素國家對照品對于延胡索酸泰妙菌素原料及制劑的生產(chǎn)及質(zhì)量控制具有重要意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備 四級桿質(zhì)譜儀(Waters XEVO TQD)；高效液相色譜儀(HPLC)(Waters e2695色譜系統(tǒng)，Empower 3色譜工作站)；二極管陣列檢測器(PDA)(Waters 2998)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 藥品與試劑 溯源對照品來源/批號：USP/F0C328；苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料藥來源：山東勝利生物工程有限公司。甲醇和乙腈(MERCK公司色譜純試劑)。其余試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 分子量測定 分別取苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料與對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并配制為10 μg/mL的溶液直接進樣。離子源為ESI源，正離子全掃描模式(ESI+)。毛細管電壓3.0 kv，錐孔電壓30 kv，脫溶劑溫度350 ℃。掃描范圍m/z100～1000 Da，采集速率1.5 spectra/s。

2.2 鑒別

2.2.1 液相鑒別 照純度檢查項下的色譜條件，取該檢查項下的供試品溶液與對照品溶液進樣，采集色譜圖，考察供試品溶液主峰與對照品溶液主峰出峰時間是否一致，紫外光譜圖是否一致。

2.2.2 紅外鑒別 參考《中國獸藥典》2015年版一部延胡索酸泰妙菌素質(zhì)量標準[1]中紅外鑒別方法，取苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料與對照品適量，采用溴化鉀壓片法制片，采集4000～400 cm-1波段紅外光譜圖，考察二者是否一致。

2.3 純度測定 采用《中國獸藥典》2015年版一部 延胡索酸泰妙菌素質(zhì)量標準[1]中含量測定項下的色譜條件測定純度，考察其純度是否符合《獸藥標準品、對照品、對照藥材質(zhì)量標準》[3]中關(guān)于定位用對照品純度不得低于90.0%的規(guī)定。十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；二極管陣列檢測器，檢測波長為212 nm，同時在200～400 nm波長范圍內(nèi)記錄光譜圖。以甲醇-碳酸銨溶液[取碳酸銨10 g，加水800 mL使溶解，加6%高氯酸溶液(取高氯酸8.5 mL，加水至100 mL，搖勻)24 mL，用水稀釋至1000 mL，搖勻，濾過]-乙腈(49∶28∶23)為流動相；流速為1.2 mL/min。分別取延胡索酸泰妙菌素對照品和苯甲磺酰截短側(cè)耳素對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成每1 mL各約含0.08 mg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，泰妙菌素峰與苯甲磺酰截短側(cè)耳素峰的分離度應大于2.0，理論板數(shù)按泰妙菌素峰計算不低于10000。取苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料適量，用流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含0.08 mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。按面積歸一化法計算苯甲磺酰截短側(cè)耳素的純度。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子量 苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料分子離子峰[M+Na]+為555.19 Da，參見圖1。USP溯源對照品分子離子峰[M+Na]+為555.18 Da，參見圖2。二者分子量一致。

3.2 鑒別

3.2.1 液相鑒別 在純度檢查項下，212 nm波長下的色譜圖中，苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料色譜圖中主峰與對照品溶液主峰保留時間一致，且為單一物質(zhì)峰(純度角度小于純度閾值)；在200 ～400 nm的波長范圍內(nèi)，兩者紫外光譜圖匹配(匹配角度小于匹配閾值)，最大吸收波長一致，可判定二者為相同物質(zhì)(圖3～圖4)。

圖1 苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料質(zhì)譜圖Fig 1 The MS spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

圖2 苯甲磺酰截短側(cè)耳素USP對照品質(zhì)譜圖Fig 2 The MS spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

圖3 苯甲磺酰截短側(cè)耳素USP對照品光譜指數(shù)圖Fig 3 The HPLC spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

圖4 苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料光譜指數(shù)圖Fig 4 The HPLC spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

3.2.2 紅外鑒別 苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料紅外光吸收圖譜與對照品一致(圖5～圖6)。

圖5 苯甲磺酰截短側(cè)耳素USP對照品紅外光譜圖Fig 5 The IR spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

圖6 苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料紅外光譜圖Fig 6 The IR spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

3.3 純度測定 溶劑空白、系統(tǒng)適用性及苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料色譜圖參見圖7～圖9。2個檢驗員各進樣一份，每份重復進樣2次。純度結(jié)果見表1。平均純度為99.7%，符合不低于90.0%的規(guī)定。

圖7 溶劑空白色譜圖Fig 7 The spectrum of solvent

圖8 系統(tǒng)適用性色譜圖Fig 8 The spectrum of system applicability

圖9 苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料色譜圖Fig 9 The spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

純度1/%純度2/%檢驗員199.7199.76檢驗員299.6399.68平均99.7

4 討論與結(jié)論

4.1 純度測定中色譜系統(tǒng)的選擇 采用高效液相色譜法測定樣品的純度，一般需至少測定2種不同類型的色譜系統(tǒng)中的純度，并將結(jié)果進行綜合考量與計算。但由于苯甲磺酰截短側(cè)耳素對照品僅在延胡索酸泰妙菌素含量測定過程中作為系統(tǒng)適用性對照品使用，故沒有考察其他色譜系統(tǒng)純度的必要性。因此，在本試驗設(shè)計過程中，純度測定的色譜系統(tǒng)僅選擇了延胡索酸泰妙菌素的含量測定色譜系統(tǒng)。

4.2 單一波段下計算得出的純度結(jié)果是否可以反映樣品的色譜純度 上述純度結(jié)果為212 nm波長下面積歸一化法計算的結(jié)果。同時采集了供試品3D色譜圖(圖10)，發(fā)現(xiàn)除溶劑空白峰外，供試品僅在7.6 min附近有雜質(zhì)，該雜質(zhì)最大吸收亦接近212 nm。故212 nm下的純度結(jié)果可以反映供試品的色譜純度。

圖10 苯甲磺酰截短側(cè)耳素原料3D色譜圖Fig 10 The 3D spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

通過考察紅外、分子量、純度等關(guān)鍵質(zhì)控項目，研制了苯甲磺酰截短側(cè)耳素國家對照品，可作為系統(tǒng)適用性對照品，用于延胡索酸泰妙菌素及其制劑含量測定的系統(tǒng)使用性檢查。