酒石酸沃尼妙林的制備和評價(jià)

朱馨樂，徐士新，趙琪，黃耀凌，李建,趙暉，李丹，孫雷

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

沃尼妙林(Valnemulin)是20世紀(jì)90年代中期正式上市的一種動(dòng)物專用抗生素，屬第二代截短側(cè)耳素類(Pleuromutilin)半合成抗生素[1-3]。具有毒性低、抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、代謝快、不易產(chǎn)生耐藥菌株、不易導(dǎo)致體內(nèi)藥物蓄積殘留等優(yōu)點(diǎn)，主要用于豬、牛、羊及家禽的支原體病和革蘭氏陽性菌感染疾病的防治[4-8]。1999年歐共體批準(zhǔn)沃尼妙林用于預(yù)防與治療豬痢疾鉤端螺旋體感染引起的和由肺炎支原體感染引起的豬地方性肺炎，2004年，批準(zhǔn)預(yù)防由結(jié)腸菌毛樣短螺旋體感染引起的豬結(jié)腸螺旋體病和治療由細(xì)胞內(nèi)勞森菌感染引起的豬增生性腸病。沃尼妙林以鹽酸沃尼妙林鹽形式應(yīng)用在獸醫(yī)臨床領(lǐng)域，但鹽酸沃尼妙林極易水解，對溫度和光照敏感，儲(chǔ)存穩(wěn)定性較差，需采用流化床工藝制備成顆粒劑使用，在制粒過程中會(huì)有1/3～1/2的有效成分損失[9-10]。在動(dòng)物口服給藥時(shí)，由于適口性差、刺激性強(qiáng)而影響采食，不利于達(dá)到預(yù)期的治療效果[11-12]。因此，急需開發(fā)新的適用于獸醫(yī)臨床的應(yīng)用形式。

本研究提出了一種沃尼妙林酒石酸鹽的制備方法，理化性質(zhì)研究表明酒石酸沃尼妙林有良好的晶形，性質(zhì)穩(wěn)定，易于儲(chǔ)存；生產(chǎn)制劑時(shí)，不需專用的高溫高壓設(shè)備，通過與飼料簡單混合即可制成預(yù)混劑，而且在制備過程中能避免有效成分的損失；在口服時(shí)，晶態(tài)鹽由于改良了適口性而更容易被動(dòng)物接受，擴(kuò)展了沃尼妙林在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用范圍(圖1)。

圖1 酒石酸沃尼妙林分子結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of valnemulin hydrogen tartrate

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 D8 ADVANCE XD-3 X-射線粉末衍射儀(德國Bruke公司)；Phillips XL30 SEM-FEG掃描電子顯微鏡(荷蘭Eindhoven公司)； Waters 2695高效液相色譜儀，配UV檢測器(美國Waters公司)；AG-285電子天平(瑞士 Metteler公司)。

1.2 試劑與藥品 沃尼妙林為康倍德化學(xué)品有限公司制備(含量95.92%)；鹽酸沃尼妙林來源為龍翔公司(含量96.30%，生產(chǎn)日期：201005)；N, N-二甲基乙酰胺、酒石酸均為分析純；乙腈、甲醇為色譜純，德國默克公司；水為超純水；酒石酸沃尼妙林標(biāo)準(zhǔn)品來源為Dr.Ehrenstorfer GmbH公司(含量98.70%，批號：Y0000533)。

1.3 酒石酸沃尼妙林的制備 在室溫的條件下，將8 g沃尼妙林溶于50 mL乙腈與N, N-二甲基乙酰胺(60∶40，V/V)組成的混合溶劑中，然后將1.6 g酒石酸加到沃尼妙林溶液中，在溫度60 ℃的條件下反應(yīng)2.0 h，直至該反應(yīng)液澄清，讓反應(yīng)液冷卻至室溫，結(jié)晶，過濾，真空過夜干燥，得到酒石酸沃尼妙林晶體。

1.4 理化性質(zhì)分析 掃描電鏡(SEM)分析：使用荷蘭Eindhoven公司Phillips XL30 SEM-FEG掃描電鏡觀察酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林固體粉末，操作電壓15 kV。X-射線衍射分析：使用由布魯克公司的Bruker-D8 ADVANCE XD-3 X-射線衍射儀測定鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林的X- 射線衍射譜。在40 kV/30mA、CuK-α1X 射線(波長=1.5406 埃)條件，在2θ為5°～ 40°的范圍，使用0.2 秒鐘計(jì)數(shù)/0.018°步長以連續(xù)模式運(yùn)行的測角計(jì)測定。

1.5 鹽酸沃尼妙林與酒石酸沃尼妙林的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.5.1 光照射試驗(yàn) 取真空干燥至恒重的樣品適量，參照(2006-2011)《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》中獸用化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，將含量為99.7%酒石酸沃尼妙林和99.0%鹽酸沃尼妙林平鋪于表面皿中，在照度為4500±500 LUX的條件放置，于0(對照)、5、10、25、60 d取樣，用高效液相色譜(HPLC)儀測試。

1.5.2 引濕性試驗(yàn) 取適量樣品平鋪于稱量瓶中，在溫度30 ℃，濕度65%和78%的條件下分別放置24、48 h，取樣測試水分吸收量。

1.5.3 高效液相色譜(HPLC)分析 沃尼妙林的含量測定和雜質(zhì)測定方法參考?xì)W洲藥典《鹽酸沃尼妙林的測定》，配置UV檢測器的Waters 2695系統(tǒng)，十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑的Waters X-Bridge 柱(4.6 mm×150 mm，3 μm particle size)進(jìn)行分離測定。

1.6 體外抑菌試驗(yàn)菌株 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林的抑菌效果，比較所選試驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度(MIC)。質(zhì)控菌株：肺炎鏈球菌ATCC 49619和其他分離菌株：胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌，豬鏈球菌、溶血巴氏菌、金黃色葡萄球菌，來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡(SEM)分析 酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林的掃描電鏡結(jié)果列于圖2?？梢钥闯鰞煞N鹽有不同的形貌，酒石酸沃尼妙林呈現(xiàn)桿狀結(jié)晶形狀，而鹽酸沃尼妙林呈現(xiàn)出大塊、易碎的片狀固體結(jié)構(gòu)。

2.2 X-射線衍射分析 酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林的X-衍射譜分析結(jié)果列于圖3。從圖3可以看出酒石酸沃尼妙林在5.563,6.361,8.741,10.560,11.223,11.891,12.775,13.486,15.048,16.384,17.689和17.689(2θ ± 0.2°)處呈現(xiàn)出特征峰，然而鹽酸沃尼妙林的X-衍射譜無特征峰出現(xiàn)，只有一個(gè)坡度變化寬展而緩和的吸收峰。

圖2 鹽酸沃尼妙林 (A)和酒石酸沃尼妙林(B)的掃描電鏡圖像Fig 2 Scanning electron micrographs (SEM) of valnemulin hydrochloride (A) and (B) valnemulin hydrogen tartrate crystal

圖3 鹽酸沃尼妙林(A)和酒石酸沃尼妙林(B)的粉末X-衍射光譜Fig 3 X-ray powder diffractometry (XRD) spectra of valnemulin hydrochloride (A) and valnemulin hydrogen tartrate crystal (B)

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 為了比較鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林理化性質(zhì)的穩(wěn)定性，進(jìn)行了光照和引濕性試驗(yàn)。圖4為鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林在0(對照)、5、10、25、60 d含量的變化，可以看出，光照60 d以后，酒石酸沃尼妙林的含量為96.2%，與99.7%的初始含量相比，降解了3.5%，然而鹽酸沃尼妙林含量的降低較明顯，由99.0%降至80.8%，即減少了18.2%。

圖4 光照條件下酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林中游離態(tài)沃尼妙林隨時(shí)間變化曲線Fig 4 Time courses of the free valnemulin levels of valnemulin hydrogen fumarate and valnemulin hydrochloride under irradiation condition.

圖5列出了鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林在相對濕度(RH)為65%和78%的條件下吸水量的變化。結(jié)果表明鹽酸沃尼妙林，在濕度65%的條件下吸水量為4.50%，而在濕度78%的條件下吸水量高達(dá)9.71%，酒石酸沃尼妙林在上述條件下的吸水量分別為1.30%、1.40%。

2.4 體外抑菌試驗(yàn) 為確定酒石酸沃尼妙林抑菌效果，進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，并與鹽酸沃尼妙林的MIC值進(jìn)行了比較。如表1所示：酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林對細(xì)菌的敏感濃度一致：對胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度均為4 μg/mL，對副豬嗜血桿菌的最小抑菌濃度均為1～4 μg/mL，對多殺巴氏菌的最小抑菌濃度均為16～32 μg/mL，對豬鏈球菌的最小抑菌濃度均為1 μg/mL，對溶血巴氏菌的最小抑菌濃度均為4 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.02 μg/mL，對質(zhì)控菌株肺炎鏈球菌的最小抑菌濃度均為16 μg/mL。

圖5 在30 ℃, 65%和78%濕度條件下酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林吸水量隨時(shí)間變化曲線Fig 5 Profiles of adsorption of water of valnemulin hydrogen tartrate and valnemulin hydrochloride samples at 30 ℃, in 60% and 78% RH.

3 討論與結(jié)論

3.1 外部形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)分析 藥物成鹽是改善藥物分子理化性質(zhì)、提高其成藥性的有效手段之一。在新藥研發(fā)早期階段，將候選化合物成鹽可改善候選化合物的理化性質(zhì)，如溶解度、結(jié)晶度、吸濕性、熔點(diǎn)和固態(tài)穩(wěn)定性，減少其不良反應(yīng)等[13-15]。藥物鹽型的篩選對選擇具有適宜藥學(xué)性質(zhì)的固態(tài)劑型有重要的指導(dǎo)作用。

由于藥物與不同的鹽類反應(yīng)條件的差異：比如溶劑、溫度、壓力、晶種，會(huì)產(chǎn)生不同的晶體/無定型態(tài)，從而產(chǎn)生不同的物理化學(xué)特性和藥學(xué)效果[15]。本研究掃描電鏡(SEM)分析結(jié)果體現(xiàn)出鹽酸沃尼妙林和結(jié)晶型酒石酸沃尼妙林形貌上的顯著差異；X-射線衍射分析表明鹽酸沃尼妙林和結(jié)晶型酒石酸沃尼妙林有不同的XRD特征，鹽酸沃尼妙林包含了一個(gè)寬展形狀、無特征吸收的峰，說明鹽酸沃尼妙林是無定形態(tài)，而酒石酸沃尼妙林的X-射線衍射圖中可以看到一組尖銳的強(qiáng)峰，且表現(xiàn)出較高的結(jié)晶度。沃尼妙林2種不同鹽類的XRD的分析結(jié)果與藥物穩(wěn)定性分析一致，表明酒石酸沃尼妙林優(yōu)良的穩(wěn)定性歸因于其晶體特性。

表1 酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林的體外抗菌活性(MIC, μg/mL)Tab 1 Antibacterial activity (MIC, μg/mL) of valnemulin hydrogen tartrate and valnemulin hydrochloride in vitro.

a最低抑菌濃度(MIC):抑制細(xì)菌生長繁殖的最低藥物濃度;bApp胸膜肺炎放線桿菌；c HPS副豬嗜血桿菌；d PM 多殺巴氏菌

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.2.1 光照對不同沃尼妙林鹽穩(wěn)定性的影響 光試驗(yàn)表明，經(jīng)60 d的照射，鹽酸沃尼妙林含量降低比較明顯，由99.0%將降至80.8%，即減少了18.2%，酒石酸沃尼妙林的含量為96.2% ，略低于99.7%，相對于鹽酸沃尼妙林，酒石酸沃尼妙林大大降低了對光照的敏感性。為了從光降解的機(jī)理方面解釋酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林光照穩(wěn)定性的差異，本研究采用圖6的液相色譜圖比較了鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林光照射試驗(yàn)降解產(chǎn)物的差異。圖6 (A1)顯示照射60 d后鹽酸沃尼妙林產(chǎn)生了一些小的降解產(chǎn)物峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間匹配，確定主要降解產(chǎn)物沃尼妙林亞砜，保留時(shí)間為6.2 min。與先前報(bào)道的富馬酸沃尼妙林的光降解產(chǎn)物——沃尼妙林亞砜研究結(jié)果相一致[16]。相反，如圖6(B1)所示，在整個(gè)60 d的光照試驗(yàn)中，酒石酸沃尼妙林幾乎沒有檢測到明顯的降解產(chǎn)物。上述結(jié)果表明酒石酸沃尼妙林晶體，穩(wěn)定性優(yōu)于無定型的鹽酸沃尼妙林。

3.2.2 濕度對不同沃尼妙林鹽穩(wěn)定性的影響 引濕性是影響化合物穩(wěn)定性的主要因素之一。酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林在不同相對濕度(RH)的條件下引濕性結(jié)果表明酒石酸沃尼妙林的吸水量增加較小，在相對濕度65%和78%的條件下的吸水量分別為1.40%、1.30%，根據(jù)2010版《中國獸藥典》，判定為具有輕微引濕性(<2%)；鹽酸沃尼妙林在濕度78%的條件下吸水高達(dá)9.71%，在濕度65%的條件下吸水也有4.50%，超出中國獸藥典規(guī)定的輕微引濕性(<2%)的限量，判定為具有引濕性。引濕性試驗(yàn)結(jié)果表明，酒石酸沃尼妙林對濕度變化不敏感，表現(xiàn)出優(yōu)越的抗吸水性，而鹽酸沃尼妙林有極強(qiáng)的吸濕性。酒石酸沃尼妙林的貯存條件不苛刻，應(yīng)用范圍更廣泛，在開發(fā)簡單和新穎的劑型方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 MIC試驗(yàn) 酒石酸沃尼妙林對革蘭陰性和革蘭陽性病原菌的體外抗菌活性試驗(yàn)MIC 值與無定形鹽酸沃尼妙林一致，二者有相同的抑菌活性，可以推斷水溶液中，酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林均可迅速解離，游離態(tài)的沃尼妙林堿發(fā)揮藥效。酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林藥效的體外抑菌試驗(yàn)等效性，以及酒石酸沃尼妙林對光照、濕度的穩(wěn)定性和動(dòng)物飼喂適口性表明晶態(tài)的酒石酸沃尼妙林，具備潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 鹽酸沃尼妙林(A)和酒石酸沃尼妙林(B)光照前(0 day)后(90 day)的高效液相色譜圖Fig 6 HPLC spectra of valnemulin hydrochloride (A) and valnemulin hydrogen tartrate(B) after irradiation for 0 and 90 days.

本研究制備了一種結(jié)晶態(tài)的沃尼妙林有機(jī)酸鹽——酒石酸沃尼妙林，用XRD和SEM對其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。XRD和SEM結(jié)果表明酒石酸沃尼妙林的形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)完全不同于鹽酸沃尼妙林，前者具有高的結(jié)晶性,而后者是無定型模式。在光照條件下，酒石酸沃尼妙林具有比鹽酸沃尼妙林更強(qiáng)的穩(wěn)定性。鹽酸沃尼妙林的光降解產(chǎn)物主要是沃尼妙林氧化亞砜。在65%和78% RH條件下鹽酸沃尼妙林樣品有吸濕性，而酒石酸沃尼妙林對濕度變化不敏感。抑菌敏感性測試試驗(yàn)表明酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林鹽有相同的抑菌活性。因此,酒石酸沃尼妙林貯存穩(wěn)定、易于制備制劑、給藥方便、減少人力物力、節(jié)約了養(yǎng)殖成本，具有應(yīng)用潛力。