RP-HPLC法測定可溶性CD95-Fc融合蛋白中異天冬氨酸的含量

于雷 陶磊 畢華 李響 饒春明

[摘要] 目的 測定可溶性CD95-Fc融合蛋白中異天冬氨酸（IsoAsp）含量。 方法 采用ISOQUANT？誖異天冬氨酸檢測試劑盒結(jié)合反相高效液相色譜法測定樣品中IsoAsp含量，采用Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18色譜柱（150 mm × 3 mm，4 μm），以7.9 mmol/L磷酸二氫鉀-1.1 mmol/L磷酸氫二鉀-10%甲醇為流動相A，以甲醇為流動相B，梯度洗脫，流速為0.43 mL/min。 結(jié)果 對照品和3批原液中IsoAsp含量相近（0.30～0.32 mol/mol sCD95-Fc），3批成品中IsoAsp含量明顯增高（0.51～0.53 mol/mol sCD95-Fc）;25℃和37℃處理24 h后成品中IsoAsp含量無明顯變化，60℃處理后明顯增加。 結(jié)論 該法適用于可溶性CD95-Fc融合蛋白中IsoAsp含量檢測，高溫處理可加快樣品中IsoAsp生成。

[關(guān)鍵詞] 可溶性CD95-Fc;異天冬氨酸;脫酰胺修飾;反相高效液相色譜

[中圖分類號] R914? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（c）-0109-04

[Abstract] Objective To determine the content of isoaspartate （IsoAsp） in soluble CD95-Fc fusion protein. Methods IsoAsp content in samples was determined by ISOQUANT?Isoaspartic Acid Detection Kit combined with reversed-phase high performance liquid chromatography. Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18 column （150 mm × 3 mm， 4 μm） was used. Potassium dihydrogen phosphate-1.1 mmol/L potassium dihydrogen phosphate-10% methanol was used as mobile phase A， methanol as mobile phase B， gradient elution was performed at a flow rate of 0.43 mL/min. Results The content of IsoAsp in reference material was similar to that in three batches of raw liquor （0.30-0.32 mol/mol sCD95-Fc）. The content of IsoAsp in three batches of finished products increased significantly （0.51-0.53 mol/mol sCD95-Fc）. The content of IsoAsp in finished products did not change significantly after 24 hours of treatment at 25℃ and 37℃， but increased significantly after treatment at 60℃. Conclusion This method is suitable for the determination of IsoAsp in soluble CD95-Fc fusion protein. High temperature treatment can accelerate the formation of IsoAsp in samples.

[Key words] Soluble CD95-Fc; IsoAsp; Deamidization; Reversed-phase high performance liquid chromatography

重組蛋白類制品的化學(xué)穩(wěn)定性對其安全性和有效性至關(guān)重要。在生產(chǎn)和儲存過程中，某些熱點(diǎn)氨基酸殘基易受到不同類型的化學(xué)修飾，包括脫酰胺、異構(gòu)化、氧化等[1]。其中，天冬酰胺（Asn）脫酰胺和天冬氨酸（Asp）異構(gòu)化是比較常見的化學(xué)修飾，兩者均會形成異天冬氨酸（IsoAsp），可能影響蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性和體外穩(wěn)定性。研究[2]表明，生產(chǎn)和儲存過程可能會對蛋白中IsoAsp的含量造成影響。因此，IsoAsp的檢測對重組蛋白類藥物極為重要，其能夠作為監(jiān)測藥物活性功能改變的重要指標(biāo)，在藥物質(zhì)量控制、制劑配方優(yōu)化、儲存條件篩選等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。目前已有大量研究[6-11]開發(fā)了針對重組蛋白的IsoAsp分析技術(shù)，尤其是單抗類制品，主要分析技術(shù)包括等電聚焦（IEF）、離子交換色譜（IEX）、疏水作用色譜（HIC）、親水作用色譜（HILIC）[5]、胰蛋白酶肽圖等。IsoAsp和Asp的分子量、電荷均相同，兩者很難區(qū)分，往往需要先將大的蛋白質(zhì)消化成小片段，經(jīng)不同方式分離后使用質(zhì)譜檢測器進(jìn)行鑒定[9，11-12]。這些方法通常耗時、低效，且在樣品處理過程可能產(chǎn)生新的IsoAsp，從而造成結(jié)果不準(zhǔn)確[10]。Promega公司推出了一款I(lǐng)SOQUANT？誖試劑盒，其基本原理是利用蛋白L-異天門冬氨酰甲基轉(zhuǎn)移酶（PIMT）催化S-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到樣品中的IsoAsp羧基上，同時SAM轉(zhuǎn)換成S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH），SAH的摩爾含量與IsoAsp相同，SAH采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離定量[4，10]。該方法快速、準(zhǔn)確，不需要質(zhì)譜檢測器，更適用于常規(guī)檢測。

可溶性CD95-Fc（soluble CD95-Fc，sCD95-Fc）融合蛋白是一種用于治療多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）和骨髓增生異常綜合征（myel-odysplasticsyndrome，MDS）的創(chuàng)新生物技術(shù)藥物[13-14]。它是由CD95胞外結(jié)構(gòu)域和IgG1抗體Fc段組成的全人源融合蛋白，可以與腫瘤細(xì)胞表面的CD95L結(jié)合，從而抑制多個信號途徑，阻斷腫瘤細(xì)胞生長[15-17]。sCD95-Fc可顯著延長復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期[18-19]。建立和完善sCD95-Fc的質(zhì)量控制體系是保障其安全性和有效性的重要手段。sCD95-Fc蛋白中的Asn位點(diǎn)均有不同程度的脫酰胺修飾，因此對樣品中IsoAsp的含量進(jìn)行監(jiān)測是非常必要的。本研究采用ISOQUANT？誖試劑盒結(jié)合RP-HPLC法測定sCD95-Fc對照品、原液和成品中IsoAsp含量，并考察不同溫度熱處理后成品中IsoAsp含量變化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜系統(tǒng)配PDA檢測器（Waters公司）、H2O3金屬浴（金銀杏生物科技公司）、Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18色譜柱（150 mm×3 mm，4 μm）（Phenomenex公司）。

1.2 試藥

ISOQUANT？誖異天冬氨酸檢測試劑盒（MA1010）購自Promega公司;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀均為國產(chǎn)分析純試劑;HPLC級甲醇購自Fisher Scientific公司。sCD9-Fc融合蛋白對照品、3批原液和3批成品為中國食品藥品檢定研究院留存樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 sCD9-Fc樣品前處理? 取出ISOQUANT？誖異天冬氨酸檢測試劑盒、sCD95-Fc對照品和樣品，解凍后于室溫平衡30 min。分別用Q水稀釋sCD9-Fc對照品和樣品至2.0 mg/mL。取對照品、樣品和Q水（空白對照）各80 μL，加入主反應(yīng)混合物（Q水∶5×反應(yīng)緩沖液∶SAM∶PIMT=16∶40∶4∶40，現(xiàn)用現(xiàn)配）80 μL，混勻后于27℃的加熱塊中放置45 min。加反應(yīng)終止液32 μL，混勻后12 000 r/min離心1 min，離心半徑3 cm，取上清上機(jī)測定。

2.1.2 異天冬氨酸-人促睡眠肽樣品制備? 異天冬氨酸-人促睡眠肽（IsoAsp-DSIP）是具有9個氨基酸的活性肽，其氨基酸序列為Trp-Ala-Gly-Gly-IsoAsp-Ala-Ser-Gly-Glu[20]。其IsoAsp摩爾濃度與蛋白摩爾濃度相同。取8 μL IsoAsp-DSIP母液（101.97 μmol/L）加入93.97 μL水，即為8.0 μmol/L。取80 μL參照“1.2.1”處理。

2.1.3 SAH對照品溶液制備? 分別采用Q水稀釋SAH對照品母液（15.00 μmol/L），制備5個不同濃度點(diǎn)SAH對照品溶液，使50 μL進(jìn)樣量中分別含有360、270、180、90、45 pmol SAH。

2.1.4 色譜條件? 流動相A：7.9 mmol/L磷酸二氫鉀-1.1 mmol/L磷酸氫二鉀-10%甲醇;流動相B：甲醇。進(jìn)樣器溫度：（5±3）℃;柱溫：（25±3）℃;泵流速：0.43 mL/min;最大柱背壓：5000 psi;PDA檢測器：210～400 nm，3D，1.2分辨率;進(jìn)樣量：50 μL;梯度洗脫。洗脫梯度見表1。

2.2 結(jié)果

2.2.1 SAH最大紫外吸收波長測定? 根據(jù)SAH對照品的3D色譜圖，5.203 min處該組分最大紫外吸收波長為259.3 nm，同時260 nm色譜圖的最大吸收峰也處于5.206 min。因此，本研究中所有的數(shù)據(jù)分析均基于260 nm色譜圖結(jié)果。

2.2.2 系統(tǒng)適用性? 序列前、中、后各進(jìn)2針270 pmol SAH對照品，以在試驗(yàn)的不同階段考察系統(tǒng)的適用性。6次進(jìn)樣的SAH峰面積RSD僅為0.36%，理論塔板數(shù)均>6000，拖尾因子均<1.5。

2.2.3 SAH標(biāo)準(zhǔn)曲線? 分別取360、270、180、90、45 pmol SAH對照品溶液，注入色譜儀，按照“2.1.4”項(xiàng)下檢測，記錄色譜峰。以3次進(jìn)樣的峰面積均值對SAH含量進(jìn)行線性回歸，得到SAH標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 1391.2x- 4272.8，R2 = 0.9998。360、270、180、90、45 pmol SAH對照品溶液及IsoAsp-DSIP樣品的色譜圖。

2.2.4 IsoAsp-DSIP回收率? 理論IsoAsp含量為8 μmol/L（pmol/μL），進(jìn)樣體積為50 μL，進(jìn)樣量為8×80/192×50=166.7 pmol。將3次進(jìn)樣的峰面積均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算實(shí)測SAH含量均值為169.5 pmol，回收率為101.7%。IsoAsp-DSIP樣品的色譜圖。

2.2.5 sCD95-Fc樣品中IsoAsp含量? 將sCD95-Fc對照品、原液和成品的峰面積均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算進(jìn)樣SAH含量。sCD95-Fc蛋白的理論分子量為87 kD，2.0 mg/mL的摩爾濃度為23.0 μmol/L（pmol/μL）。進(jìn)樣sCD95-Fc蛋白含量為23.0×80/192×50=479.2 pmol。3批原液與參考品相近，而3批成品的IsoAsp含量明顯增加。結(jié)果見表2。

2.2.6 熱處理后sCD95-Fc成品中IsoAsp含量變化? 本研究采用熱加速實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步考察儲存過程對sCD95-Fc成品中IsoAsp含量的影響。將同一支樣品分裝至4個離心管中，分別于4℃、25℃、37℃和60℃放置24 h，同法測定IsoAsp含量。25℃、37℃下放置的樣品與4℃下放置的樣品比較，其IsoAsp含量無明顯變化，而60℃處理后，其IsoAsp含量明顯增加。不同溫度處理后IsoAsp含量見表3，sCD95-Fc成品P01的色譜圖。

3 討論

本研究采用ISOQUANT？誖試劑盒結(jié)合RP-HPLC法測定sCD95-Fc對照品、原液和成品中的IsoAsp含量。對照品和原液的IsoAsp含量為0.30～0.32 mol/mol sCD95-Fc。sCD95-Fc對照品和原液中，除了N-糖基化位點(diǎn)的Asn之外，其他幾個位點(diǎn)的Asn均有不同程度的脫酰胺修飾，其中第6位修飾率為14%左右，第312位為12%左右，兩者理論上貢獻(xiàn)IsoAsp含量為0.28 mol/mol sCD95-Fc，再加上另外幾個Asn位點(diǎn)的潛在修飾（2%左右）以及Asp異構(gòu)化形成的IsoAsp（極少量），IsoAsp總含量為30%左右。

3批成品間和3批原液間IsoAsp含量均相似，提示該產(chǎn)品不同批次的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定。原液和對照品的IsoAsp含量相近，而成品中IsoAsp含量比原液增加了70%。分析原因可能有以下幾點(diǎn)：①制劑緩沖液成分、穩(wěn)定劑能可能引起Asn脫酰胺或Asp異構(gòu)化;②制劑pH與原液不同;③儲存溫度，原液和對照品儲存于-70℃，而成品儲存于4℃，溫度升高可能會引起IsoAsp生成速率加快。為進(jìn)一步考察儲存溫度對IsoAsp含量的影響，將sCD95-Fc成品分別于4℃、25℃、37℃和60℃放置24 h后測定其IsoAsp含量。結(jié)果顯示，盡管25℃和37℃下放置的樣品與4℃下放置的樣品比較，其IsoAsp含量無明顯變化，但是60℃處理后，其IsoAsp含量明顯增加，提示高溫加速了IsoAsp的生成。綜上所述，儲存條件對IsoAsp生產(chǎn)速率影響顯著，IsoAsp含量的檢測對指導(dǎo)制劑配方優(yōu)化和儲存條件的篩選具有重要意義。此外，IsoAsp含量的監(jiān)測也可成為考察生產(chǎn)工藝及儲存過程穩(wěn)定性的重要方式。

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（收稿日期：2018-03-23? 本文編輯：王? ?蕾）