不同凍存時間對人顆粒脂肪活性影響的實(shí)驗研究

魏國茜 顧洛莎 伍明政 白潔 顧勁松 于江 閆潤虎 張怡

[摘要] 目的 探索不同凍存時間對人顆粒脂肪活力的影響，尋求更為滿意的顆粒脂肪凍存時間，為臨床自體脂肪移植提供理論依據(jù)。 方法 收集2016年6～10月廣州廣美整形美容醫(yī)療門診部20～40歲行大腿內(nèi)側(cè)自體脂肪抽吸移植術(shù)女性41例的脂肪標(biāo)本，經(jīng)生理鹽水漂洗2次靜置分離后加入相應(yīng)留存脂肪量等體積的低溫凍存保護(hù)液于-196℃（液氮）凍存。選擇凍存3個月（A組）和6個月（B組）的標(biāo)本復(fù)溫，通過蘇木精-伊紅（HE）及臺盼藍(lán)染色觀察凍存脂肪細(xì)胞形態(tài)并計算脂肪細(xì)胞存活率，肌酸激酶測定酶活力、免疫組化CD105檢測脂肪干細(xì)胞（ADSCs）數(shù)量，比較A、B兩組脂肪細(xì)胞活力變化情況。 結(jié)果 脂肪細(xì)胞計數(shù)分析脂肪細(xì)胞存活率及肌酸激酶測定結(jié)果顯示，在相同低溫條件下兩組脂肪細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;HE染色顯微鏡下比較脂肪細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，A、B兩組脂肪細(xì)胞形態(tài)基本正常，僅于A組見少數(shù)ADSCs。 結(jié)論 使用液氮凍存人顆粒脂肪組織安全有效，于-196℃下凍存6個月，甚至更長時間，是較理想的凍存條件。

[關(guān)鍵詞] 顆粒脂肪;冷凍保存;儲存時間;脂肪細(xì)胞活力

[中圖分類號] R622.9? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（c）-0016-04

[Abstract] Objective To explore the effect of different cryopreservation time on human adipose cell vitality， and seek a more satisfactory granular fat cryopreservation time， to provide a theoretical reference for autologous fat transplantation in clinic. Methods The fat granule samples from interior thigh of 41 healthy women （20-40 years old） that underwent conventional liposuction were collected in Guangmei Medical Plastic and Cosmetic Outpatient Department from June to October 2016. All fat granule samples were cryopreserved in liquid nitrogen freezer of -196℃ after washed twice by physiological saline and placed quiescently to isolate them from the physiological saline and then an equal volume of freezing protection liquid was added into the fat granule samples. The samples that had been stored for 3 months （group A） and 6 months （group B） were selected to test the activity of frozen fat after thawed. The morphology and the death cell percentage of cryopreserved granule fat cells was observed and calculated respectively by hematoxylin-eosin （HE） staining and trypan-blue staining. The creatine kinase level was tested to calculate fat cell enzyme vitality. The CD105 on adipose derived stem cells （ADSCs） was detected by immunohistochemical methods to compare the effect of different cryopreservation time on the fat cell activity in vitro. Results Fat cell count analysis on the survival rate of fat cells and the determination of creatine kinase showed no statistically significant differences in the fat cell survival rates between group A and group B under the same cryopreservation temperature （P > 0.05）. The comparative observation of the fat cell morphology by HE staining under the microscope showed that all cell membranes keep well in the two groups. Immunohistochemical staining of CD105 showed that there were only a few of ADSCs in group A. Conclusion Cryopreservation of human granular adipose tissue with liquid nitrogen is safety and effective. The fat cells can be cryopreserved at -196℃ for 6 months or even longer time， and this cryopreserved temperature is ideal.

[Key words] Fat granule; Cryopreservation; Stored time; Fat cell vitality

自體脂肪移植已成為整形美容外科修復(fù)、重建的首選材料[1-2]。但其移植后的過度吸收問題尤為普遍，有研究[3-7]表明移植8～12個月后自體移植脂肪體積多減少至移植時體積的30%～60%。因此，臨床上常需少量、多次移植才可達(dá)到預(yù)期效果，但多次手術(shù)操作勢必會對患者帶來過多身心痛苦、手術(shù)風(fēng)險及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如能就同一患者一次手術(shù)抽取額外足量脂肪，體外長期凍存，再次需要時，復(fù)溫后直接注射，即可避免上述問題。然而，對于脂肪組織取材后凍存方法、溫度、時間及凍存后脂肪細(xì)胞活力，國內(nèi)外學(xué)者報道不一，目前凍存時間多在3個月左右，超過1年者鮮有報道。相關(guān)研究[8-22]結(jié)論多傾向于溫度越低，凍存效果越好。鑒于自體脂肪移植后再吸收較多出現(xiàn)在術(shù)后3～6個月，5個月后方可完全再生[23]，因此臨床需要采取重復(fù)注射和補(bǔ)救手術(shù)的時間往往在此時段。有學(xué)者報道深低溫凍存大鼠和人脂肪組織3個月和6個月獲得了良好效果[16-17，19]。但在此時段凍存人顆粒脂肪組織的研究報道較少，故本研究選取凍存3、6個月人體脂肪組織進(jìn)行研究，以探索該凍存時間內(nèi)脂肪細(xì)胞的活力，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 臨床資料? 收集2016年6～10月經(jīng)廣州廣美整形美容醫(yī)療門診部行大腿內(nèi)側(cè)自體脂肪抽吸移植術(shù)求美女性的脂肪標(biāo)本共86例，排除丟失、破損及其他不符合條件者，最終選取41例，年齡20～40歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病例經(jīng)術(shù)前血常規(guī)、感染五項、血生化及心電圖檢查無異常，排除傳染病、代謝性疾病者。②術(shù)前均簽署手術(shù)知情同意書。③吸脂部位：大腿內(nèi)側(cè);④獲取方式：2.5 mm直徑雙孔鈍頭吸脂針連接10 mL注射器負(fù)壓下手動吸脂。⑤純化方式：生理鹽水洗滌2次后靜置分層;⑥低溫凍存保護(hù)液：60%小牛血清+25%DMEM高糖培養(yǎng)基+15%DMSO;⑦凍存時間分別達(dá)到3個月或6個月。不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者一律排除。本研究經(jīng)廣美整形美容醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.1.2 主要試劑及儀器? 國產(chǎn)小牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）、膠原酶Ⅰ（北京索萊寶科技有限公司）、臺盼藍(lán)染料（北京索萊寶科技有限公司）、肌酸激酶（CK）測試盒（南京建成生物工程研究所）、多聚甲醛（PFA）（上海生工生物工程股份有限公司）、OCT包埋劑（美國櫻花SAKURA冷凍包埋劑）、小鼠SP檢測試劑盒（北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司）、Anti-CD105抗體[MEM-229]（FITC，英國Abcam公司）;正置熒光顯微鏡（U-RFL-T，日本Olympus公司）、倒置熒光顯微鏡（IX71，日本Olympus公司）、冰凍切片機(jī)（HM525，美國賽默飛世爾科技公司）、酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、深低溫冰箱（美國賽默飛世爾科技公司）、液氮罐（成都金鳳液氮容器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 顆粒脂肪組織的獲取與純化處理? 術(shù)前大腿內(nèi)側(cè)吸脂區(qū)域畫線，常規(guī)碘伏消毒，鋪巾。于吸脂區(qū)域邊緣2%利多卡因局部浸潤麻醉，做一約0.3 cm皮膚切口為進(jìn)針口，皮下止血鉗稍做鈍性分離，在吸脂區(qū)域皮下脂肪層均勻注射腫脹麻醉液（每500 mL生理鹽水中加入2%利多卡因20 mL、腎上腺素0.5 mL），使皮下脂肪腫脹變硬，皮膚外觀呈橘皮樣改變。待麻醉起效后，10 mL注射器連接2.5 mm直徑雙孔鈍頭吸脂針，止血鉗固定注射器活塞于10 mL刻度處，吸脂針針孔向下，進(jìn)行扇形多層次多隧道往復(fù)抽吸。獲取的顆粒脂肪組織經(jīng)生理鹽水漂洗2次純化處理，靜置后保留第2層純化的顆粒脂肪組織，一部分用于移植填充，另外每例留取足量顆粒脂肪標(biāo)本，一式3份，分別按2.5 mL×2和1 mL×1盛入高壓滅菌后的5 mL和1.8 mL凍存管中并加入相應(yīng)留存脂肪量等體積低溫凍存保護(hù)液（60%小牛血清+25%DMEM高糖培養(yǎng)基+15%DMSO），凍存于-196℃液氮罐。

1.2.2 顆粒脂肪組織的凍存? 將與低溫凍存保護(hù)液混合后的顆粒脂肪組織按照慢凍原則分別凍存。4℃冰箱冷藏室預(yù)冷30 min，放入普通冰箱冷凍室4 h，轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱中凍存24 h后，置于液氮中凍存。

1.2.3 顆粒脂肪組織的分組? 從41例標(biāo)本中將凍存時間達(dá)到3個月標(biāo)本18例命名為A組;凍存時間達(dá)到6個月標(biāo)本23例命名為B組。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2.4 顆粒脂肪組織復(fù)溫? 將標(biāo)本取出后，迅速置于37℃水浴箱中解凍，輕柔晃動至完全融化，立即吸出凍存管中低溫保護(hù)液，顆粒脂肪以PBS緩沖液洗3遍，洗去殘留凍存液后待實(shí)驗。

1.2.5 臺盼藍(lán)染色法脂肪細(xì)胞計數(shù)? ①臺盼藍(lán)母液的配置：稱取4 g臺盼藍(lán)干粉加入少量雙蒸水進(jìn)行研磨，加入雙蒸水至100 mL，配制成4%臺盼藍(lán)母液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。②取顆粒脂肪1 mL加入3 mL 0.1%Ⅰ型膠原酶（組織量∶消化酶=1∶3）置于37℃恒溫氣浴振蕩器中，180 r/min，消化30 min。③等體積生理鹽水中和消化液，終止消化。于100目銅網(wǎng)過濾，濾過物靜置4 min。④取第二層脂肪細(xì)胞懸液100 μL于0.5 mL離心管中，加入100 μL 0.4%臺盼藍(lán)染液，吹打混勻，染色2～3 min。⑤吸取10 μL混合液滴入放好蓋玻片的血細(xì)胞計數(shù)板上方凹槽處，于倒置顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞。在倒置顯微鏡200×下隨機(jī)選取3個計數(shù)方格，觀察脂肪細(xì)胞并計數(shù)（活細(xì)胞拒染呈無色透明樣，死細(xì)胞染成淡藍(lán)色）取平均值。⑥脂肪細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/（死亡細(xì)胞數(shù)+活細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.6 肌酸激酶測定比較脂肪細(xì)胞活力? ①取顆粒脂肪0.5 mL，加生理鹽水1.5 mL，放入組織研磨器內(nèi)，在冰水浴內(nèi)進(jìn)行組織研磨，破碎脂肪細(xì)胞。②研磨后的脂肪組織勻漿，離心5000 r/min，離心2 min，吸取離心后的中層液0.25 mL，加入0.25 mL生理鹽水稀釋。③將CK試劑盒中試劑一至試劑五按比例混合后37℃預(yù)溫5 min，取20 μL待測樣本加入300 μL混合試劑，混勻后37℃水浴20 min。④加入100 μL試劑六，混勻，3500 r/min離心10 min。⑤取離心后上清液300 μL，加入配置好的定磷液2000 μL。⑥37℃水浴下于2 min后吸取1000 μL于96孔板（每孔100 μL，每孔設(shè)3復(fù)孔）于酶標(biāo)儀630 nm下測定OD值，比較各組酶活力大小。

1.2.7 HE染色? （1）冰凍切片的制備：①固定。向盛有脂肪組織標(biāo)本的凍存管中加入PFA至最大刻度處，水平搖床震蕩20 min。②脫水。吸出PFA，加入等體積15%蔗糖溶液，震蕩2～3 h后換30%蔗糖溶液震蕩12 h。③包埋。OCT包埋劑浸沒包埋組織塊，低溫速凍。置于恒溫冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片，于-80℃深低溫冰箱中保存待用。（2）HE染色：①取冰凍切片，烤片后用PBS洗去包埋劑3 min×2次;②HE染色;③由低到高梯度酒精脫水;④雙二甲苯固定;⑤中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察并拍照;⑥按照是否存在完整有核脂肪細(xì)胞、囊腔和空泡，對細(xì)胞膜的破裂程度、網(wǎng)格連接連續(xù)性進(jìn)行評估。

1.2.8 免疫組織化學(xué)染色? ①取冰凍切片，切片制備同HE染色。②3%H2O2去離子水孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。③滴加SP試劑盒中A試劑室溫孵育15 min，傾去試劑。④滴加CD105抗體，4℃過夜，PBS洗3 min×2次。⑤滴加試劑B，室溫孵育15 min，PBS洗3 min×2次。⑥滴加試劑C，室溫孵育15 min，PBS洗3 min×2次。⑦DAB顯色劑顯色室溫10～20 min，顯微鏡下觀察顯色情況，顯色充分后，自來水沖洗。⑧蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，雙二甲苯固定。⑨中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪細(xì)胞存活率

臺盼藍(lán)染色后于倒置顯微鏡下觀察，死亡脂肪細(xì)胞被染成藍(lán)色，成活脂肪細(xì)胞不著色。。倒置顯微鏡計算各組脂肪細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示A、B兩組脂肪細(xì)胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 肌酸激酶測定

標(biāo)本復(fù)溫后，通過CK試劑盒測定分析脂肪細(xì)胞活力，在反應(yīng)2 min后于630 nm下行OD值測定，A、B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 HE染色

HE染色下，正常脂肪細(xì)胞呈空泡狀、網(wǎng)狀連接，細(xì)胞膜染成紫紅色、胞核呈深紫色，居于細(xì)胞一側(cè)。A、B組標(biāo)本冰凍切片后HE染色顯微鏡（200×）下觀察比較脂肪細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，A、B組脂肪細(xì)胞形態(tài)基本保持正常，胞膜連續(xù)完整，凍存后基本未受損傷。

2.4 免疫組織化學(xué)染色

各組標(biāo)本經(jīng)CD105染色后，僅于A組中找到少數(shù)脂肪干細(xì)胞（ADSCs）因切片位置的不確定性及數(shù)量過少不具備統(tǒng)計分析條件，故未做干細(xì)胞數(shù)量對比分析。

3 討論

目前冷凍技術(shù)已應(yīng)用到多個學(xué)科領(lǐng)域，有關(guān)組織凍存的溫度選擇，較常見的凍存溫度是4℃（普通家用冰箱冷藏室）、-20℃（普通家用冰箱冷凍室）、-80℃（深低溫冰箱）及-196℃（液氮）。-80℃（深低溫冰箱）條件下可在相對較長時間保持較高組織活力，-196℃（液氮）環(huán)境下，組織和細(xì)胞內(nèi)各種酶的活力及代謝近乎于零，即所謂“生命懸滯狀態(tài)”，理論上，在液氮中組織和細(xì)胞可以無限期儲存[24]。但臨床實(shí)踐中，凍存多長時間而不致細(xì)胞喪失活性，各研究報道不一。自體脂肪移植后再吸收較多出現(xiàn)在術(shù)后3～6個月，5個月后方可完全再生[23]。據(jù)此，本實(shí)驗選擇-196℃下分別凍存3個月及6個月的顆粒脂肪標(biāo)本，通過臺盼藍(lán)染色計數(shù)脂肪細(xì)胞數(shù)量、CK測定脂肪細(xì)胞活力、HE染色觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)、免疫組化CD105染色計數(shù)脂肪干細(xì)胞數(shù)量比較脂肪細(xì)胞活力的變化。

Shoshani等[11]將抽吸獲取的脂肪顆粒凍存于-18℃普通冰箱中保存2周后融化注入裸鼠體內(nèi)，15周后測量移植物重量、體積及組織學(xué)檢測，與新鮮脂肪組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為冷凍脂肪組織生存最關(guān)鍵的階段是凍結(jié)和解凍的過程，而不是凍存時間的長短[11，25]。如果能夠在冷凍降溫、加熱升溫的過程中避免冰晶的產(chǎn)生，或雖有冰晶形成但未對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)造成影響，即實(shí)現(xiàn)所謂的“玻璃化儲存理論”，就能避免或減輕冷凍保存對細(xì)胞的損傷，較好地維持細(xì)胞的活力[26]。因此，我們在標(biāo)本凍存過程中也盡量實(shí)現(xiàn)“玻璃化”儲存，采用“兩步法”，即“部分玻璃化”的方法，先采取一般速率進(jìn)行降溫，讓細(xì)胞外溶液中產(chǎn)生冰，使細(xì)胞內(nèi)水分外滲，胞內(nèi)溶液濃度逐漸增高;第二步再以較快的速度進(jìn)行降溫，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)溶液玻璃化。這樣的操作可能對保持細(xì)胞活性具有積極作用。

本研究結(jié)果提示，臺盼藍(lán)染色顯示兩組脂肪細(xì)胞成活率無明顯差異。CK檢測兩組酶活力基本一致。HE染色提示兩組脂肪細(xì)胞形態(tài)基本保持正常，凍存后基本未受損傷。CD105實(shí)驗中兩組標(biāo)本檢出ADSCs數(shù)量均較少，不具備統(tǒng)計分析的條件，故未做兩組間的差異性分析。

綜上，經(jīng)-196℃凍存的人體顆粒脂肪組織，至少在6個月內(nèi)能夠保持細(xì)胞的基本形態(tài)和活力，說明深低溫凍存人顆粒脂肪組織安全有效。以后將進(jìn)一步進(jìn)行延長凍存時間的相關(guān)研究，為臨床應(yīng)用提供有力依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Pu LL，Yoshimura K，Coleman SR. Future Perspectives of Fat Grafting [J]. Clinics in Plastic Surgery，2015，42（3）：389-394.

[2]? Falah M，Rayan A，Srouji S. Storage effect on viability and biofunctionality of human adipose tissue-derived stromal cells [J]. Cytotherapy，2015，17（9）：1220-1229.

[3]? Ha KY，Park H，Park SH，et al. The Relationship of a Combination of Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells and Frozen Fat with the Survival Rate of Transplanted Fat [J]. Arch Plast Surg，2015，42（6）：677-685.

[4]? Hwang SM，Lee JS，Kim HD，et al. Comparison of the viability of cryopreserved fat tissue in accordance with the thawing temperature [J]. Arch Plast Surg，2015，42（2）：143-149.

[5]? Shu Z，Gao D，Pu LL. Update on cryopreservation of adipose tissue andadipose-derived stem cells [J]. Clin Plastic Surg，2015，42（2）：209-218.

[6]? Cui XD，Gao DY，F(xiàn)ink BF，et al. Cryopreservation of human adipose tissues [J]. Cryobiology，2007，55（3）：269-278.

[7]? Simonacci F，Bertozzi N，Grieco MP，et al. Procedure，applications，and outcomes of autologous fat grafting [J]. Ann Med Surg（Lond），2017，20：49-60.

[8]? Minonzio G，Corazza M，Mariotta L，et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate [J]. Cryobiology，2014，69（2）：211-216.

[9]? Foumier PF. Facial recontouring with fat grafting [J]. Dermatol Clin，1990，8（3）：523-537.

[10]? 高景恒.長期冷凍脂肪的移植[J].實(shí)用美容整形外科雜志，2001，12（6）：332-334.

[11]? Shoshani O，Ullmann Y，Shupak A，et al. The Role of Frozen Storage in Preserving Adipose Tissue Obtained by Suction-Assisted Lipectomy for Repeated Fat Injection Procedures [J]. Dermatol Surg，2001，27（7）：645-647.

[12]? 肖斌，劉毅.脂肪顆粒組織在不同低溫條件下凍存后活力分析及移植成活率測定[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2007，13（2）：97-100.

[13]? Li BW，Liao WC，Wu SH，et al. Cryopreservation of fat tissue and application in autologous fat graft：in vitro and in vivo study [J]. Aesthetic Plast Surg，2012，36（3）：714-722.

[14]? Choudhery MS，Badowski M，Muise A，et al. Cryopreservation of whole adipose tissue for future usein regenerative medicine [J]. J Surg Res，2014，187（1）：24-35.

[15]? 鄧穎，劉少倩，謝紅炬，等.海藻糖對脂肪細(xì)胞凍存后存活率的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2017，42（5）：507-510.

[16]? 張廣宇，于冬梅，羅賽，等.不同低溫條件保存的大鼠脂肪自體移植后成活率的研究[J].中國美容整形外科雜志，2016，27（3）：181-185.

[17]? 仇侃敏，吳蒙，梁耀蟬，等.不同凍存液保存的顆粒性脂肪組織活力及移植成活率分析[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014， 34（4）：536-540.

[18]? 程愛娟，劉春霞.凍存顆粒脂肪組織移植成活率的實(shí)驗研究[J].菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校學(xué)報，2017，29（2）：1-3，7.

[19]? Atik B，ztürk G，Erdoan E，et al. Comparison of techniques for long-term storage of fat grafts：An experimental study [J]. Plast Reconstr Surg，2006，118（7）：1533-1537.

[20]? 陳苑雯，王婧薷，廖選，等.溫度對脂肪顆粒及脂肪干細(xì)胞活性的影響[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2017，23（1）：47-51.

[21]? 李春明，劉毅.人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存方法的改進(jìn)[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2007，16（8）：1026-1028.

[22]? 肖斌，劉毅，張緒生，等.脂肪顆粒組織在不同低溫條件下凍存后活力分析及移植成活率測定[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2007，13（2）：97-100.

[23]? Bellini E，Grieco MP，Raposio E. The science behind autologous fat grafting [J]. Ann Med Surg（Lond），2017，24：65-73.

[24]? 肖斌，劉毅.脂肪組織的體外儲存[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2005，14（2）：233-235.

[25]? Jang TH，Park SC，Yang JH，et al. Cryopreservation and its clinical applications [J]. Integr Med Res，2017，6（1）：12-18.

[26]? Choudhery MS，Badowski M，Muise A，et al. Cryopreservation of whole adipose tissue for future use in regenerative medicine [J]. J Surg Res，2014，187（1）：24-35.

（收稿日期：2018-08-17? 本文編輯：金? ?虹）