乳腺癌術(shù)前中醫(yī)證型及VEGF-C表達與預后的關系*

王媛媛，吳佩莼，黃盈，姚曉東，劉春鵬，吳璇，王少洪

汕頭市中心醫(yī)院 1病理科，2中醫(yī)科，3乳腺診療中心(廣東汕頭 515031)

乳腺癌是女性發(fā)病率第一的惡性腫瘤，2015年美國癌癥協(xié)會(American Cancer Society，ACS)公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌排名女性惡性腫瘤發(fā)病率第1位，病死率第2位，且每年以0.2%的速度遞增[1]。乳腺癌也是中國女性發(fā)病率最高的癌癥，癌癥死亡原因位居第6位，且正以每年3%的速度遞增，年齡也呈逐漸年輕化的趨勢[2]。目前通常采用西醫(yī)TNM分期進行預后評估及選取治療方式的依據(jù)，而中醫(yī)暫無公認有效預后評估的指標。中醫(yī)強調(diào)整體觀念，堅持辨證論治。按照患者病因病機及癥狀體征作為分型基礎，同時辨證分型也是中醫(yī)治療的基礎，所以辨證分型可能作為中醫(yī)預后判斷指標。國內(nèi)眾多學者將乳腺癌分為不同辨證分型，但缺乏統(tǒng)一和公認的癥型[3]，且缺少不同癥型的生存分析、復發(fā)率及癥型判斷分子指標。淋巴管生成因子VEGF-C(vascular endothelial growth factor-C)通過淋巴管生長因子受體促使腫瘤周圍新生淋巴管，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[4-5]。本研究通過分析術(shù)前中醫(yī)辨證分型與生存分析及VEGF-C的關系，探討按照肝郁痰凝型、沖任失調(diào)型、正虛毒熾型3種證型對預后判斷價值及不同癥型VEGF-C的表達差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取汕頭市中心醫(yī)院2014年1月至2015年1月收治的原發(fā)性乳腺癌患者91例，年齡32～81歲，中位年齡52歲，腫瘤最大徑1～8 cm，平均(3.3±1.57)cm。病理診斷由2位乳腺病理亞專科高級醫(yī)師診斷，ER≥30%確定為陽性。病理分級Ⅰ級4例，Ⅱ級71例，Ⅲ級16例，其中淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移32例。TNM分期Ⅰ期13例，Ⅱ期62例，Ⅲ期16例。中醫(yī)辨證分型為肝郁痰凝型29例，沖任失調(diào)型35例，正虛毒熾型27例。

1.2 中醫(yī)辨證分型 參考國家中醫(yī)藥管理局頒布的《中醫(yī)病癥診斷療效標準》(ZY/T001.2-94)及相關文獻[6]。將乳腺癌患者分為3個證型：(1)肝郁痰凝型：乳房部觸及腫塊，外觀無明顯改變，質(zhì)地偏硬，移動性差，邊界不清；性情急躁胸悶肋脹，心煩易怒，情志難舒，或伴經(jīng)前期乳房脹滿，口苦咽干，舌淡紅、苔薄黃或膩苔、脈弦滑；(2)沖任失調(diào)型：乳房腫塊堅硬，難以移動，伴有經(jīng)期紊亂，且經(jīng)前乳房脹痛明顯，婚后未育或多次流產(chǎn)史，伴有月經(jīng)不調(diào)、腰腿酸軟、五心煩熱和口干、舌紅、苔少、脈弦細；(3)正虛毒熾型：乳房腫塊明顯極易觸及，皮膚表面破潰，水滲流，污穢惡臭，疼痛明顯，間或紅腫，甚則潰爛翻花，久則氣血衰敗，正氣大虧，精神萎靡，面色晦暗無光，消瘦乏力，納差，眠差，或發(fā)熱、心煩、口干、便秘、舌紫暗、苔黃、脈弱。參照該標準由2名副主任醫(yī)師資格的中醫(yī)婦科醫(yī)生對所有患者進行術(shù)前辨證分型。

1.3 納入標準 所有患者均為在我院手術(shù)及隨訪患者。經(jīng)病理組織學證實為原發(fā)性乳腺癌。無全身感染性疾病，肝腎功能不全、高泌乳癥及內(nèi)分泌異常及Ⅳ期患者。TNM分期包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，無合并其他腫瘤，術(shù)前均未接受放療、化療。患者簽署知情同意書。

1.4 隨訪 全部患者采用電話或門診等隨訪方式。以出院日后開始實施隨訪。所有病例隨訪時間截止2018年5月，隨訪時間14～49個月，復發(fā)20例，無病生存71例。

1.5 試劑來源及方法 VEGF-C購自北京中杉金橋生物公司，DAB顯色試劑盒購自上海長島生物技術(shù)有限公司。VEGF-C用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH值4.0)高壓修復5 min，用PBS代替一抗作陰性對照。用已知的陽性切片作為陽性對照。

1.6 免疫組化結(jié)果判定 VEGF-C染色評估由2位病理高級職稱醫(yī)師進行雙盲評估。以細胞膜或者細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒且強弱不等作為陽性細胞。參照文獻[7]根據(jù)陽性細胞程度和陽性細胞百分比乘積結(jié)果進行半定量評估。在400×光鏡下(腫瘤細胞著色區(qū)域，順序移動玻片)隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，細胞質(zhì)無著色為0分，淡黃染色為1分，棕黃色為2分，棕褐色或胞質(zhì)內(nèi)棕黑色顆粒為3分；細胞陽性數(shù)目<5%為0分，≥5%且<25%為1分，≥25%且<50%為2分，≥50%且<75%為3分，≥75%為4分。將兩者相乘判斷實驗結(jié)果?！?分為陽性，<3分為陰性。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，采用2檢驗比較組間差別。應用Kaplan-Meier進行生存分析，多因素Cox回歸模型確定獨立危險因素，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C在乳腺癌的表達與臨床病理參數(shù)的關系 VEGF-C表達在胞質(zhì)中，棕黃色顆粒狀(圖1)，91例乳腺癌組織中VEGF-C的陽性率為61.54%，VEGF-C的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)，與年齡、腫瘤最大徑、ER、分子分型、TNM分期、分級無關(P>0.05)。見表1。

VEGF-C陽性定位在細胞質(zhì)或細胞膜

表1 乳腺癌VEGF-C表達與臨床病理參數(shù)的關系例(%)

2.2 乳腺癌術(shù)前中醫(yī)分型與臨床病理因素及VEGF-C表達的關系 不同術(shù)前中醫(yī)癥型腫瘤最大徑、分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分級、TNM分期、VEGF-C的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而年齡、ER表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 不同中醫(yī)辨證分型及臨床病理因素與乳腺癌患者復發(fā)率關系 91例患者總體復發(fā)率為21.98%(20/91)，Her-2過表達型(44.44%)、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組(34.38%)、Ⅲ級(50.00%)、Ⅲ期(62.50%)、正虛毒熾型(48.15%)復發(fā)率高(P<0.05)。按照年齡、ER、腫瘤最大徑、VEGF-C分組復發(fā)率無差別(P>0.05)，見表3。

2.4 乳腺癌生存曲線分析 應用Kaplan-Meier生存曲線顯示不同中醫(yī)癥型、腫瘤分級、TNM分期、分子分型無病生存期有差別(P<0.05)，見圖2。按照ER、年齡、VEGF-C、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、最大徑分組，生存期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單因素分析顯示中醫(yī)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分級、TNM分期，HER-2表達是預后的影響因素(P<0.05)，見表4。將有意義的單因素列入多因素分析顯示中醫(yī)癥型、分子分型、腫瘤最大徑是獨立預后因素。見表5。

表2 乳腺癌中醫(yī)辨證分型與臨床病理因素及VEGF-C的關系 例(%)

表3 乳腺癌臨床病理參數(shù)、中醫(yī)辨證分型與復發(fā)率的關系 例(%)

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)學從患者病因病機和全身癥狀體征出發(fā)，將辨證論治作為核心,而證型恰恰是辨證論治的前提和基礎。目前在乳腺癌術(shù)前證型研究方面眾說紛多，缺乏規(guī)范化、統(tǒng)一化、現(xiàn)代化的乳腺癌中醫(yī)證候分型，因此不能進行有效的臨床轉(zhuǎn)化。分型雖異，但均認為肝郁、氣血、毒熱為重要的致病因素[8]。本研究按照此觀點將乳腺癌分為肝郁痰凝型、沖任失調(diào)、正虛毒熾型3種癥型，探討此3種癥型作為術(shù)前預后判斷價值。

A:腫瘤分級; B:分子分型; C:中醫(yī)癥型; D: TNM分期

表5 乳腺癌Cox多因素分析

目前很多學者研究中醫(yī)癥型預后不同可能存在于微環(huán)境中的分子機制。發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在不同中醫(yī)癥型表達不同[11]。VEGF是表達在血管內(nèi)皮細胞，通過促進微血管增生促進腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，腫瘤微血管生長有可能作為中醫(yī)分型指標[12]。并且可能通過抑制腫瘤血管生成抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及生長[13]，從而轉(zhuǎn)變患者癥型。但是在不同中醫(yī)癥型淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異少見報道。VEGF-C是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一特異淋巴管內(nèi)皮細胞刺激因子，通過特異性地激活淋巴管內(nèi)皮上的受體VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，F(xiàn)lt-4)，導致受體VEGFR-3酪氨酸磷酸化,誘導淋巴管的生成并影響淋巴管內(nèi)皮的通透性,從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。本文通過免疫組化方法研究VEGF-C在不同癥型乳腺癌組織中表達差異。發(fā)現(xiàn)VEGF-C正虛毒熾型表達率最高，在肝郁痰凝型表達率最低。因此，正虛毒熾型更易發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，通過抑制該型淋巴道轉(zhuǎn)移有可能抑制腫瘤進展。

綜上所述，乳腺癌術(shù)前中醫(yī)辨證分型預后判斷有一定價值。肝郁痰凝型預后最好，其次沖任失調(diào)型，正虛毒熾型最差。VEGF-C在不同癥型間表達有差異，推測臨床病理參數(shù)及VEGF-C可能為中醫(yī)辨證分型提供客觀化評定指標。