NGF聯(lián)合b-FGF對胚胎大鼠隔區(qū)來源神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的誘導(dǎo)作用*

朱清，陳艷△，龍大宏，楊丹迪，徐麗萍，王迪

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科(廣東廣州 510260)； 2廣州醫(yī)科大學(xué)人體解剖實(shí)驗(yàn)室(廣東廣州 510260)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)是一種多分化潛能干細(xì)胞，具有干細(xì)胞自我更新、增殖、分化的一般特征。胚胎哺乳動物的大部分腦區(qū)，如皮層、海馬、隔區(qū)等部位可分離培養(yǎng)出NSC[1]。NSC的多分化潛能為阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞移植治療提供可能，但如何誘導(dǎo)NSC分化為神經(jīng)元及膽堿能神經(jīng)元成為AD干細(xì)胞移植治療的關(guān)鍵之一。有文獻(xiàn)報道神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元[2-4]，本研究組前期成功對新生鼠基底前腦進(jìn)行NSC分離、培養(yǎng)與鑒定。2016年4月至2017年3月，本實(shí)驗(yàn)旨在分離培養(yǎng)胚胎大鼠隔區(qū)來源神經(jīng)干細(xì)胞，采用NGF聯(lián)合b-FGF誘導(dǎo)對其分化為神經(jīng)元的作用進(jìn)行觀察，為NSC來源及誘導(dǎo)分化神經(jīng)元提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑 孕13～15 d清潔級SD大鼠(實(shí)驗(yàn)動物合格證明：NO：008279)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；D-Hanks平衡鹽溶液、Accutase酶、多聚賴氨酸、牛血清白蛋白(bovine serum protein，BSA)、B27、N2添加劑、DMEM/F12(1∶1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液、Neurobasal培養(yǎng)液(Gibco公司)；b-FGF、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、NGF(Peprotech公司)；兔抗nestin抗體、小鼠抗GFAP抗體、兔抗β-tubulin Ⅲ抗體(Sigma公司)；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 胚胎大鼠隔區(qū)來源NSC的分離與培養(yǎng) SD孕鼠斷頸處死，酒精消毒，取出子宮后，轉(zhuǎn)到無菌環(huán)境中取出胎鼠，快速取出腦組織置于盛有預(yù)冷D-Hanks平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中(置于冰上)。解剖顯微鏡下，用眼科鑷從腹部內(nèi)側(cè)向背部外側(cè)剔除腦膜，沿側(cè)腦室前角、丘腦邊緣垂直切入，分離隔區(qū)腦組織，預(yù)冷D-Hanks平衡鹽溶液中漂洗后，轉(zhuǎn)入另一盛有預(yù)冷DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中(置于冰上)，眼科剪將隔區(qū)腦組織剪成<1 mm3小塊，吸管輕柔吹打至肉眼不可見組織塊，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗細(xì)胞1次，再次離心收集細(xì)胞(方法同上)，棄上清，加入NSC增殖培養(yǎng)液(DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液+2% B27+20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF)重懸細(xì)胞。0.4%臺盼藍(lán)顯微鏡下活細(xì)胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105·mL-1，每瓶10 mL，加入25 mL培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，2～3 d原代神經(jīng)球形成，采用沉淀法2～3 d換液1次，約4～5 d后按1∶3傳代。

1.3 神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化 取P2代神經(jīng)球，加入accutase消化酶，室溫下消化3～5 min，吸管輕柔吹打十余次；1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞(方法同上)，棄上清，加入NSC誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液∶Neurobasal培養(yǎng)液為1∶3+1%B27+0.5%N2)重懸細(xì)胞，以1×106·mL-1接種于0.1%賴氨酸包被100 mm培養(yǎng)皿及24孔板。分組誘導(dǎo)分化：(1)對照組：不添加生長因子；(2)NGF組：添加NGF至50 ng/mL誘導(dǎo)分化；(3)NGF聯(lián)合b-FGF組，添加NGF至50 ng/mL、bFGF至10 ng/mL。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱。3 d后半量換液，NGF聯(lián)合b-FGF組bFGF減量至5 ng/mL，余誘導(dǎo)條件不變。3 d后再次換液時NGF聯(lián)合b-FGF組撤除bFGF，余誘導(dǎo)條件不變。繼續(xù)誘導(dǎo)分化至第7天，每3 d半量換液1次。

1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測與細(xì)胞計數(shù) 取P2代神經(jīng)球懸液2 mL，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，接種于2個0.1%賴氨酸包被24孔板，6 h后神經(jīng)球貼壁，細(xì)胞免疫熒光染色，一抗為兔抗Nestin多抗(1∶400)，進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞鑒定，另一板自然分化5 d后，細(xì)胞免疫熒光染色，一抗為兔抗β-Tubulin Ⅲ多抗(1∶240)及小鼠抗GFAP單抗(1∶600)，進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能鑒定。取誘導(dǎo)分化7 d的24孔板內(nèi)細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色，一抗為兔抗β-Tubulin Ⅲ多抗(1∶240)，進(jìn)行β-Tubulin Ⅲ陽性細(xì)胞計數(shù)。具體步驟如下：輕柔吸出培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，10%BSA(含0.2%Triton×100)封閉處理約40 min。吸干封閉液，加入相應(yīng)一抗。4℃冰箱過夜，次日加入相應(yīng)二抗FITC標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶100)、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶100)，室溫下避光孵育2 h。DAPI復(fù)染15 min(室溫、避光)。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

每組隨機(jī)抽取5個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，統(tǒng)計β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元比例并進(jìn)行統(tǒng)計分析。NSCs分化為神經(jīng)元比率=(β-Tubulin Ⅲ陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI標(biāo)記的細(xì)胞數(shù))×100%，即β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元比例。

2 結(jié)果

2.1 SD胎鼠大腦隔區(qū)來源NSC的分離和原代培養(yǎng) 采用機(jī)械法制備成單細(xì)胞懸液后，倒置顯微鏡下觀察，大多數(shù)為單個細(xì)胞，懸浮于培養(yǎng)液中，呈球形，周邊有清晰的光暈，折光性強(qiáng)，培養(yǎng)1～2 d后，隨著培養(yǎng)時間的推移，細(xì)胞分裂相增多，出現(xiàn)由細(xì)胞克隆增殖形成的神經(jīng)干細(xì)胞球，2～3 d左右形成多個細(xì)胞組成的克隆球。繼續(xù)培養(yǎng)，克隆球中細(xì)胞數(shù)量和體積都不斷增加。原代培養(yǎng)到第4～5天時，神經(jīng)干細(xì)胞球中細(xì)胞數(shù)量一般由上百個細(xì)胞組成，密集成團(tuán)，并出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)的融合。見圖1。

A:培養(yǎng)2～3 d的神經(jīng)球；B:培養(yǎng)4～5 d的神經(jīng)球

2.2 NSC的鑒定 對NSC克隆球用Nestin抗體細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示NSC克隆球呈綠色的陽性反應(yīng)，證實(shí)傳代培養(yǎng)獲得的NSC克隆球?yàn)镹SC。見圖2。

2.3 NSC分化潛能的鑒定 1 d 后可見培養(yǎng)細(xì)胞貼附于多聚賴氨酸包被的24孔板，細(xì)胞開始貼壁，分化第3～5天，貼壁細(xì)胞可見突起生長，表現(xiàn)出特化的細(xì)胞形態(tài)。有的細(xì)胞體積大，伸出2條長突起和一些小突起，呈神經(jīng)元形態(tài)；有的細(xì)胞自胞體起伸出許多細(xì)的中等長度的突起，呈星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)；有的細(xì)胞胞體伸出的突起少而粗，為少突膠質(zhì)細(xì)胞。進(jìn)行GFAP、β-Tubulin Ⅲ 染色證實(shí)為膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元，倒置熒光顯微鏡下拍照可見GFAP、β-Tubulin Ⅲ陽性細(xì)胞。證實(shí)所獲得的NSC可分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。見圖3。

2.4 NSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元 NGF組、NGF聯(lián)合b-FGF組細(xì)胞生長良好，β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元胞體較大、突起較長，且交織成網(wǎng)狀，其中，NGF聯(lián)合b-FGF組β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元胞體更大、突起更長，見圖4。對照組、NGF組、NGF聯(lián)合b-FGF組β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元分化率分別為(21.80±2.81)%、(38.04±3.86)%、(50.01±7.65)%。NGF聯(lián)合b-FGF組神經(jīng)元分化率高于NGF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且兩組神經(jīng)元分化率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A:Nestin染色；B:DAPI染色；C:Nestin/DAPI

3 討論

NSC具有自我更新能力及多向分化潛能，可以自我復(fù)制更新，產(chǎn)生與自身相同的子代細(xì)胞，并可增殖分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。眾多研究報道表明，NSC無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1∶1的DMEM/F12混合培養(yǎng)基，為了維持NSC的干細(xì)胞特性，必須添加促細(xì)胞有絲分裂并保持未分化狀態(tài)的生長因子。其中鼠來源NSC原代培養(yǎng)添加的絲裂原因子主要是EGF和b-FGF，兩者被證實(shí)能促進(jìn)胚胎或成年鼠NSC的分裂增殖。此外，還需添加B27或N2等其他成分，B27更能促進(jìn)原代培養(yǎng)NSC的分裂增殖。培養(yǎng)方法主要有神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)及貼壁培養(yǎng)，目前已報道文獻(xiàn)中，多采用神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)NSC[5-8]。本研究中，所用SD胎鼠的胎齡為13～15 d，取材參照文獻(xiàn)[9]分離隔區(qū)。利用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1∶1 DMEM/F12)添加20 ng/mL EGF、20 ng/mL b-FGF及2% B27，神經(jīng)球懸浮法培養(yǎng)NSC。可見NSC生長良好，2～3 d即可形成懸浮的折光性好的克隆球，4～5 d后神經(jīng)球明顯增大，并可出現(xiàn)神經(jīng)球的融合。單細(xì)胞克隆培養(yǎng)，5 d后亦可見小的NSC細(xì)胞克隆球形成，證實(shí)所得細(xì)胞具有自我增殖的能力。本研究中采用Nestin細(xì)胞免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)所得神經(jīng)球呈nestin陽性，進(jìn)一步證實(shí)為NSC。此外，我們還對傳代2～3次后NSC進(jìn)行Nestin細(xì)胞免疫熒光檢測，結(jié)果亦為陽性。這些結(jié)果表明，胚胎大鼠隔區(qū)來源神經(jīng)干細(xì)胞球的傳代細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中也能維持較高的不分化的干細(xì)胞狀態(tài)。

A:GFAP染色；B:DAPI染色；C:GFAP/DAPI;D:β-Tubulin Ⅲ染色；E:DAPI染色；F:β-Tubulin Ⅲ/DAPI

本研究中，神經(jīng)干細(xì)胞球自分化培養(yǎng)5～7 d，細(xì)胞從神經(jīng)球向外爬出，可見胞體呈錐體狀、突起較長并向兩側(cè)生長的細(xì)胞，以及胞體肥大、突起較短且多的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞免疫熒光檢測可見β-Tubulin Ⅲ及GFAP陽性細(xì)胞，證實(shí)獲得的NSC可分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元比例為(22.89±2.18)%，高于本研究組新生鼠來源NSC及文獻(xiàn)報道胚胎大鼠隔區(qū)來源NSC自分化為神經(jīng)元的比例[10-11]，可能與取材時大鼠年齡有關(guān)，早期的大腦多能干細(xì)胞在胚胎第10天出現(xiàn)，呈FGF依賴性，F(xiàn)GF依賴性干細(xì)胞進(jìn)一步成熟后，EGF促進(jìn)其增殖，在胚胎14 d后出現(xiàn)EGF反應(yīng)性細(xì)胞，在發(fā)育的早期階段，存在FGF及EGF依賴性共存期。除某些特異性腦區(qū)外，在胚胎第11～17天持續(xù)存在神經(jīng)發(fā)生先于星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化[12-13]。張鳳蘭等[14]研究顯示，在小鼠大腦發(fā)育過程中，隨著胎齡增加，分離培養(yǎng)的小鼠全腦和大腦皮層組織中神經(jīng)干細(xì)胞比例逐漸降低，本實(shí)驗(yàn)過程中，亦發(fā)現(xiàn)胎齡>16 d后，所得NSC的β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元比例下降。

A、B、C:對照組；D、E、F：NGF組；G、H、I：NGF聯(lián)合b-FGF組

雖文獻(xiàn)報道胚胎大鼠隔區(qū)及皮層來源NSC自分化為神經(jīng)元的比例并無差異，但有文獻(xiàn)報道NGF誘導(dǎo)隔區(qū)來源NSC分化為神經(jīng)元及膽堿能神經(jīng)元的比例高于皮層來源NSC[15]。因此本研究選擇隔區(qū)來源NSC誘導(dǎo)分化，以期探索神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的更有效方法。本研究中，NGF誘導(dǎo)隔區(qū)來源NSC分化為神經(jīng)元比例高于對照組，與文獻(xiàn)報道一致，提示NGF可提高NSC分化為神經(jīng)元的比列，NGF促進(jìn)NSC分化為神經(jīng)元可能與其促進(jìn)PI3K/Akt信號通路Akt的磷酸化、MAPK/Erk信號通路Erk1/2磷酸化等有關(guān)[16-18]。文獻(xiàn)報道，多種神經(jīng)營養(yǎng)因子可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號途徑，參與神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，神經(jīng)營養(yǎng)因子的聯(lián)合使用較單一因子有更好的促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元的作用[19-21]。Chen等[22]在NGF、BDNF、b-FGF 3種因子單獨(dú)或聯(lián)合使用誘導(dǎo)NSC分化為神經(jīng)元的研究中，發(fā)現(xiàn)含有b-FGF 的聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)組神經(jīng)元分化比例明顯高于不含b-FGF組，本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在逐漸撤除bFGF條件下，NGF誘導(dǎo)NSC分化為神經(jīng)元的作用優(yōu)于NGF對照組，與文獻(xiàn)結(jié)果相似，b-FGF聯(lián)合NGF可能協(xié)同作用于PI3-K/Akt等信號途徑，促進(jìn)神經(jīng)元誘導(dǎo)分化。

總之，NSC的存在并成功分離培養(yǎng)，為NSC移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病、腦損傷、腦血管病、脊髓損傷等提供了豐富的細(xì)胞來源。同時，亦使NSC體外誘導(dǎo)分化及其機(jī)制研究得以深入開展。本研究采用懸浮神經(jīng)球法成功分離培養(yǎng)胚胎大鼠隔區(qū)來源NSC，免疫熒光鑒定為Nestin陽性NSC，并可分化為GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞及β-Tubulin Ⅲ陽性神經(jīng)元。b-FGF聯(lián)合NGF可提高其分化為神經(jīng)元的比例，但其誘導(dǎo)NSC分化為神經(jīng)元的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。