哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞磷酸二酯酶4D基因啟動(dòng)子甲基化的研究*

李曉鸞，朱怡卿，王芳，商艷

1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科(河北石家莊050031)； 2海軍軍醫(yī)大學(xué)(第二軍醫(yī)大學(xué))基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室(上海 200433)； 3海軍軍醫(yī)大學(xué)(第二軍醫(yī)大學(xué))長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(上海 200433)

磷酸二酯酶4D(phosphodiestarase 4D，PDE4D)基因是環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)特異性的磷酸化酶家族成員，是磷酸二酯酶存在于氣道平滑肌細(xì)胞中的主要形式[1]。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，PDE4D基因參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控，包括細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移[2-4]?；蚪M范圍的相關(guān)性分析顯示，PDE4D是一個(gè)哮喘易感基因[5]。同時(shí)，功能學(xué)研究表明，PDE4D在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6-7]。通過調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞中cAMP的水平，PDE4D基因敲除能夠顯著緩解卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠的氣道反應(yīng)[8]。然而，調(diào)控PDE4D基因在哮喘患者表達(dá)改變的分子機(jī)制，目前仍不清楚。本課題組前期研究表明，HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織的基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)甲基化水平發(fā)生顯著改變。由于PDE4D基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化修飾位點(diǎn)，2016年1月至2017年12月，本研究通過屋塵螨(house dust mite,HDM)誘導(dǎo)小鼠哮喘模型，檢測(cè)對(duì)照組與模型組小鼠PDE4D基因DNA甲基化水平的差異，以探究DNA甲基化修飾對(duì)PDE4D基因表達(dá)的調(diào)控作用，為挖掘哮喘治療的新靶點(diǎn)提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 12只SPF級(jí)6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，平均體重約22 g，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為兩組，每組6只，分別為對(duì)照組和模型組。HDM購(gòu)自美國(guó)Greer Labs公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒：日本Takara公司，細(xì)胞DNA抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自美國(guó)ZYMO Research公司。

1.2 屋塵螨誘導(dǎo)哮喘模型構(gòu)建 將HDM溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制為終濃度1 mg/mL的溶液，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)給予小鼠腹腔注射以致敏，模型組每只小鼠給予100 μg HDM，對(duì)照組的小鼠給予100 μL 磷酸鹽緩沖液，實(shí)驗(yàn)第14和21天分別給予小鼠氣道滴注以致敏，模型組每只小鼠給予50 μg HDM，對(duì)照組每只小鼠給予50 μL 磷酸鹽緩沖液，最后一次免疫48 h后，進(jìn)行氣道反應(yīng)檢測(cè)并處死小鼠。

1.3 小鼠氣道反應(yīng)激發(fā)檢測(cè) 最后一次HDM免疫48 h后，給予每只小鼠腹腔注射1 %戊巴比妥麻醉，保留呼吸。分別在頸外靜脈、氣管和食管進(jìn)行插管，將氣管和導(dǎo)管與呼吸速度描記儀連接，同時(shí)測(cè)定氣體流速和潮氣量。待小鼠穩(wěn)定后，通過氣道內(nèi)霧化給予小鼠濃度為0.1、0.3、1、3、10、30 mg/mL的乙酰甲膽堿溶液，計(jì)算給藥后肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(dynamic compliance，Cdyn)和氣道阻力(resistance，Re)，并計(jì)算小鼠氣道反應(yīng)性。

1.4 肺泡灌洗及細(xì)胞計(jì)數(shù) 處死小鼠后，將小鼠進(jìn)行仰臥位固定，暴露氣管并進(jìn)行氣管插管，用1 mL磷酸鹽緩沖液進(jìn)行肺泡灌洗。瑞氏染液染色后，在光學(xué)顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.5 肺組織切片制備 取小鼠右肺，用4 %多聚甲醛溶液固定，固定12 h后，制成石蠟組織切片，蘇木精-伊紅 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，在顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)變化。

1.6 Real-time PCR檢測(cè)小鼠氣道平滑肌細(xì)胞PDE4D的mRNA表達(dá) 從小鼠氣道中分離獲得氣道平滑肌細(xì)胞，依據(jù)說明書，采用TRIzol提取細(xì)胞總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，并通過一步法將總RNA反轉(zhuǎn)成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序：37℃ 15 min →85℃ 15 s，以cDNA為底物進(jìn)行mRNA的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見列表1，反應(yīng)程序：95℃ 10 min→(95℃ 30 s→60℃ 15 s→72℃ 20 s)×45個(gè)循環(huán)→72℃ 10 min。以GAPDH作為內(nèi)參基因，定量方法選用2-△△CT法，計(jì)算得PDE4DmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化亞硫酸氫鹽測(cè)序 依據(jù)說明書提取氣道平滑肌細(xì)胞基因組DNA，并采用EZ DNA Methylation Kit試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，具體反應(yīng)步驟參見試劑盒說明書(ZYMO Research公司)。根據(jù) GenBank中提供的PDE4D基因序列，結(jié)合Methyl Primer Express Software v1．0軟件，設(shè)計(jì)重亞硫酸鹽測(cè)序引物，引物序列見列表1。采用Takara公司的高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序：95℃ 10 min→ (95℃ 10 s →55℃ 30 s→72℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)→72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化純化回收，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)菌株，涂板，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取6個(gè)陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，送生工生物工程(上海)測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺功能檢測(cè) 對(duì)照組和模型組小鼠的氣道阻力均隨著乙酰甲膽堿劑量的升高而增加，在乙酰甲膽堿濃度為3～30 mg/mL時(shí)，模型組小鼠的氣道阻力顯著上升，而對(duì)照組小鼠的氣道阻力上升較少，HDM致敏顯著提高了小鼠對(duì)乙酰膽堿的氣道反應(yīng)。見圖1、表2。

圖1 小鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果

2.2 肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 與對(duì)照組比較，模型組小鼠的肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目均顯著增加。見表3。

2.3 小鼠肺組織HE染色結(jié)果 對(duì)照組小鼠支氣管黏膜上皮完整，纖毛排列整齊，管腔較為光滑，內(nèi)未見明顯的炎癥細(xì)胞侵入(圖2-A)。而模型組小鼠支氣管黏膜基底層增厚，明顯水腫，管腔積有大量黏液，同時(shí)大量嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等細(xì)胞浸潤(rùn)氣道黏膜層、肺泡腔及肺泡壁中(圖2-B)。

組別n0.1 mg/mL0.3 mg/mL1 mg/mL3 mg/mL10 mg/mL30 mg/mL對(duì)照組60.52±0.021.82±0.212.18±0.423.77±0.675.92±0.989.32±3.1模型組60.48±0.032.46±0.334.03±0.6111.87±2.1?17.34±2.3?21.73±3.6?

*與對(duì)照組比較P<0.05

組別n細(xì)胞總數(shù)(×105·mL-1)分類計(jì)數(shù) (×102·mL-1)中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞對(duì)照組61.09±0.713.49±0.689.16±1.431.21±0.34模型組69.23±1.92?11.74±1.62?33.98±5.57?42.76±8.81?

*與對(duì)照組比較P<0.05

A: 對(duì)照組; B: 模型組

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠氣道平滑肌細(xì)胞PDE4D基因mRNA的表達(dá)PDE4D基因在對(duì)照組和模型組小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示，模型組小鼠中PDE4D基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組小鼠，是其4.35倍。見圖3。

2.5 甲基化區(qū)域亞硫酸氫鹽測(cè)序結(jié)果 對(duì)照組小鼠PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度為(31.9±6.2)%，模型組甲基化程度為(3.8±0.54)%，模型組甲基化水平顯著低于對(duì)照組。

3 討論

近年來，哮喘的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷攀升。哮喘是一種復(fù)雜的、多因素的氣道慢性疾病。哮喘的主要病理特征包括，氣道高反應(yīng)、慢性炎癥和氣道重塑[9-10]。經(jīng)典理論認(rèn)為，氣道慢性炎癥是氣道重塑的基礎(chǔ)，上皮纖維性病變、平滑肌細(xì)胞基質(zhì)沉積、平滑肌表皮增厚是慢性炎癥的結(jié)果，抗炎藥物是哮喘治療的主要靶點(diǎn)[11-12]。然而，最新的研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥并不是氣道高反應(yīng)的唯一誘因，Baroffio等[13]的研究指出，一些哮喘患者并不具有氣道慢性炎癥。PDE4D是主要分布于氣道平滑肌細(xì)胞中的一類磷酸二酯酶，可通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，由G蛋白耦聯(lián)受體和腺苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)的信號(hào)通路，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和收縮，引發(fā)高氣道反應(yīng)。同時(shí)，Thomas等[14]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的氣道平滑肌細(xì)胞中β2-腎上腺素受體介導(dǎo)的cAMP水平紊亂與PDE4D表達(dá)上調(diào)也密切相關(guān)。目前，PDE4D基因在哮喘發(fā)生中作用及調(diào)控PDE4D基因在哮喘患者表達(dá)改變的分子機(jī)制仍有待研究。因此，本研究以HDM致敏建立了C57BL/6小鼠哮喘模型，檢測(cè)PDE4D基因在哮喘小鼠表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中PDE4D基因表達(dá)升高了4.35倍。該結(jié)果提示，HDM致敏可以促進(jìn)PDE4D基因的表達(dá)，進(jìn)而引起氣道平滑肌細(xì)胞的形態(tài)改變。

*與對(duì)照組比較P<0.05

隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，氣道平滑肌細(xì)胞功能的改變與其表觀遺傳學(xué)修飾的變化密切相關(guān)[15-16]。表觀遺傳修飾主要包括：組蛋白修飾、DNA甲基化以及非編碼RNA。一些特異性的組蛋白修飾的改變可以通過促進(jìn)炎癥因子、生長(zhǎng)因子等的表達(dá)來調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞的表型[17]。Clifford等[18]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者氣道平滑肌細(xì)胞組蛋白H3K18乙?；揎椝降脑黾涌梢砸餋XCL8基因啟動(dòng)子處p300結(jié)合能力的增強(qiáng)，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖能力。此外，氣道平滑肌細(xì)胞中特異性的微小RNA(microRNA，miRNA)的表達(dá)改變也會(huì)影響其增殖能力、收縮能力、遷移能力等表型[19-20]。DNA甲基化是最常見、也是目前為止研究最為深入的與哮喘相關(guān)的表觀遺傳學(xué)修飾。DNA甲基化主要通過干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合、促進(jìn)組蛋白去乙酰化及競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位等途徑，促使基因沉默、抑制基因表達(dá)[21-22]。空氣污染、生物污染等外界環(huán)境中的危險(xiǎn)因素均可以通過改變某些基因的甲基化修飾誘發(fā)哮喘[23-24]。一項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，生活在空氣污染較為嚴(yán)重的地區(qū)的兒童的哮喘發(fā)病率增加與其內(nèi)叉頭框蛋白P3的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平異常升高密切相關(guān)[25]。此外，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，暴露于HDM誘導(dǎo)因素的哮喘模型小鼠的基因組的整體甲基化水平發(fā)生了顯著改變。由此，我們猜測(cè)DNA甲基化可能參與了PDE4D基因表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而參與了哮喘的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠氣道平滑肌細(xì)胞PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG位點(diǎn)的總體甲基化水平顯著低于對(duì)照組小鼠。該結(jié)果提示，PDE4D基因表達(dá)情況和其特異性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)相關(guān)，HMD致敏可通過調(diào)控DNA甲基化改變PDE4D基因的表達(dá)。

總之，致敏因素HDM可以通過誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞PDE4D基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾水平降低，增加PDE4D基因表達(dá)，改變氣道平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)功能，促進(jìn)哮喘的發(fā)生。PDE4D啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化調(diào)控是哮喘發(fā)生的重要機(jī)制，也是哮喘治療的潛在靶點(diǎn)。