畢赤酵母甘露寡糖對(duì)大腸桿菌攻毒斷奶仔豬免疫細(xì)胞數(shù)量的影響

■李玉欣 王海彥 韓 博

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京華美源生物科技有限公司，北京 101199）

斷奶是仔豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中繼出生后的第二個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，由于營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和心理因素的作用，導(dǎo)致仔豬極易受到病原微生物的侵害而感染大腸桿菌病、氣喘病和沙門(mén)氏菌病等[1]，其中致病性大腸桿菌是導(dǎo)致仔豬斷奶腹瀉和死亡的一個(gè)主要原因[2]，腸道黏膜免疫是近些年才發(fā)展起來(lái)的一個(gè)獨(dú)特的研究領(lǐng)域，動(dòng)物正常生理狀態(tài)時(shí)，腸道免疫系統(tǒng)與大量抗原接觸，腸黏膜既要對(duì)食源性抗原產(chǎn)生正確的免疫應(yīng)答反應(yīng)，保障機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化吸收，又要產(chǎn)生免疫防御功能，抵抗外來(lái)抗原物質(zhì)的入侵，小腸上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量的變化可以反映腸道的局部免疫狀況[3]。本試驗(yàn)使用大腸桿菌攻毒模擬現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中仔豬腹瀉及腸道損傷條件下，研究畢赤酵母甘露寡糖對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腸上皮細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量變化與分布的影響，探討畢赤酵母甘露寡糖的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所使用的畢赤酵母甘露寡糖標(biāo)識(shí)含量為：甘露糖≥15%、甘露寡糖≥20%、蛋白質(zhì)≥25%，水分≤6%和粗灰分≤2%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與日糧

本試驗(yàn)選用48頭平均體重為7.34 kg的健康斷奶仔豬，共飼養(yǎng)24 d。試驗(yàn)初期分為兩個(gè)日糧處理組：對(duì)照組和0.2%畢赤酵母甘露寡糖組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中額外添加0.2%畢赤酵母甘露寡糖，每個(gè)處理組設(shè)12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2頭仔豬，所有飼糧均為干粉料（基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1）。

表1 斷奶仔豬試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧的組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物管理

試驗(yàn)在北京市海淀區(qū)蘇家坨鄉(xiāng)蘇三四種豬場(chǎng)進(jìn)行。該場(chǎng)保育舍為全封閉式豬舍，屋頂排氣扇通風(fēng)，舍內(nèi)溫度、通風(fēng)強(qiáng)度和濕度均為自動(dòng)化系統(tǒng)控制，試驗(yàn)豬只采取單籠飼養(yǎng)方式區(qū)分，豬舍內(nèi)溫度變化控制在（28.0±2.5）℃，干粉料飼喂，自由采食和飲水。豬舍內(nèi)漏縫金屬地板，不銹鋼可調(diào)式料槽，乳頭式飲水器。按豬場(chǎng)常規(guī)管理程序和免疫程序進(jìn)行飼喂和免疫接種。

1.4 大腸桿菌攻毒液體制備

本試驗(yàn)攻毒所用2株大腸桿菌均為致病性大腸桿菌非模式菌株，其血清型分別為O64∶K99（C83709）、O138∶K88（C83905）。每種菌株接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，經(jīng)過(guò)37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h后離心收集菌體，并用PBS緩沖液洗滌、復(fù)溶到PBS緩沖液中調(diào)整到攻毒濃度，在試驗(yàn)進(jìn)行到第14 d時(shí)，對(duì)照組、畢赤酵母甘露寡糖組的1/2仔豬每天每頭灌服30 ml濃度為1010CFU/ml（2個(gè)菌株按50∶50混合）的大腸桿菌培養(yǎng)液，另1/2的對(duì)照組和酵母甘露寡糖組的仔豬灌服相同劑量的PBS無(wú)菌培養(yǎng)液作為大腸桿菌攻毒的對(duì)照，直至灌服大腸桿菌攻毒組出現(xiàn)腹瀉癥狀為止。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)逐個(gè)稱(chēng)量每頭試驗(yàn)仔豬的空腹體重，計(jì)算試驗(yàn)期間的平均日增重；每天9：00和17：00觀察仔豬排糞情況并評(píng)分（見(jiàn)表2），腹瀉指數(shù)=糞便分?jǐn)?shù)之和/試驗(yàn)仔豬頭數(shù)；于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集料槽中的剩余飼料，計(jì)算試驗(yàn)期間的平均日采食量；根據(jù)平均日增重和平均日采食量計(jì)算飼料效率。于試驗(yàn)第24 d，將各試驗(yàn)組所有豬只提前12 h停食空腹待宰，處死后分別取十二指腸、空腸和回腸中段測(cè)定上皮間淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量。

表2 仔豬腹瀉指數(shù)評(píng)分

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-Way ANO?VA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，比較各個(gè)處理間的差異性用Dun?can's方法進(jìn)行多重比較，P＜0.05時(shí)確定為有顯著差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母甘露寡糖對(duì)大腸桿菌攻毒后斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

表3 日糧中添加畢赤酵母甘露寡糖對(duì)大腸桿菌攻毒后斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

大腸桿菌攻毒的試驗(yàn)組的末重和平均日增重明顯優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。大腸桿菌攻毒組15～21 d仔豬的腹瀉指數(shù)顯著高于不攻毒組（P＜0.05），試驗(yàn)組的腹瀉指數(shù)低于對(duì)照組。大腸桿菌攻毒明顯降低了對(duì)照組試驗(yàn)?zāi)┲睾推骄赵鲋兀≒＜0.05）。日糧中添加0.2%畢赤酵母甘露寡糖能夠改善大腸桿菌攻毒對(duì)仔豬造成的試驗(yàn)?zāi)w重和平均日增重的負(fù)面影響。

2.2 畢赤酵母甘露寡糖對(duì)大腸桿菌攻毒后斷奶仔豬腸道黏膜免疫細(xì)胞數(shù)量的影響（見(jiàn)表4）

由表4可知，大腸桿菌不攻毒情況下，畢赤酵母甘露寡糖可以提高斷奶仔豬腸黏膜上皮間淋巴細(xì)胞的數(shù)量，畢赤酵母甘露寡糖(試驗(yàn)組)還有降低各段仔豬腸道黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)，但差異均不顯著（P＞0.05）。

大腸桿菌攻毒可以顯著提高回腸黏膜上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05），大腸桿菌攻毒也可以顯著提高十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05），大腸桿菌攻毒有降低對(duì)照組各段腸道黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 畢赤酵母甘露寡糖對(duì)斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸免疫細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量的影響

與大腸桿菌不攻毒相比，給斷奶仔豬補(bǔ)充畢赤酵母甘露寡糖可以減緩大腸桿菌攻毒導(dǎo)致的空腸黏膜上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量升高的趨勢(shì)，但對(duì)照組和試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）。畢赤酵母甘露寡糖顯著降低了大腸桿菌攻毒組回腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05）。畢赤酵母甘露寡糖對(duì)大腸桿菌攻毒導(dǎo)致十二指腸和空腸肥大細(xì)胞降低有減緩作用，但各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論與分析

3.1 畢赤酵母甘露寡糖對(duì)大腸桿菌攻毒后生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)在試驗(yàn)后期對(duì)一半的仔豬進(jìn)行致病性大腸桿菌攻毒，并且導(dǎo)致攻毒仔豬出現(xiàn)黃色軟糞腹瀉癥狀，降低了平均日采食量和后期的增重速度，因此對(duì)照組攻毒仔豬出現(xiàn)了飼料效率下降的現(xiàn)象。試驗(yàn)15～21 d試驗(yàn)組仔豬攻毒后的腹瀉指數(shù)低于攻毒對(duì)照組，而且平均日采食量和飼料效率沒(méi)有下降，說(shuō)明畢赤酵母甘露寡糖能夠提高斷奶仔豬對(duì)大腸桿菌攻毒的抵抗力，因而提高生長(zhǎng)性能。

3.2 腸道黏膜免疫細(xì)胞數(shù)量的影響

正常健康生理狀況下，上皮淋巴細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定的水平，當(dāng)受到外界病原菌或斷奶等刺激時(shí)，淋巴細(xì)胞從血液向腸道上皮中遷移[4]，起到修復(fù)腸黏膜損傷和清除病原菌等作用。這是本試驗(yàn)在大腸桿菌攻毒后上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)為顯著增加的主要原因。杯狀細(xì)胞是一種典型的糖蛋白分泌細(xì)胞，其分泌的黏蛋白釋放到腸腔后變成潤(rùn)滑性黏液分布于上皮表面，起到保護(hù)腸黏膜的作用。本試驗(yàn)用大腸桿菌攻毒后，與不攻毒相比，十二指腸和空腸對(duì)照組中的杯狀細(xì)胞表現(xiàn)增加明顯，是機(jī)體腸道黏膜局部細(xì)胞免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)形式之一。

在應(yīng)激狀態(tài)下，一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)肥大細(xì)胞通過(guò)脫顆粒反應(yīng)釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子IL-1、IL-6、INF-γ等[5]，這些介質(zhì)和細(xì)胞因子作用于組織細(xì)胞和趨化細(xì)胞，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞大量分泌炎癥因子[6]，放大炎癥反應(yīng)過(guò)程，影響腸道屏障功能[7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明在大腸桿菌不攻菌情況下，畢赤酵母甘露寡糖可引起小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，肥大細(xì)胞數(shù)量降低，說(shuō)明酵母甘露寡糖可以提高腸黏膜細(xì)胞的免疫力，對(duì)外源病原菌起免疫監(jiān)視作用。

4 結(jié)論

試驗(yàn)表明畢赤酵母甘露寡糖能夠改善大腸桿菌攻毒對(duì)仔豬造成生長(zhǎng)速度和飼料效率的負(fù)面影響；畢赤酵母甘露寡糖能增加上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明畢赤酵母甘露寡糖可以提高腸黏膜細(xì)胞的免疫反應(yīng)。