基于抗氧化活性的復(fù)合酶法提取香菇菌糠多糖的工藝優(yōu)化

■林 杉 冮 潔譚皎敏 韋 勝 劉 潔 馬海龍

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

香菇（Lentinus edodes）別稱花菇，為真菌門側(cè)耳科[1]。香菇多糖是香菇菌絲體中最重要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[2-4]、抗衰老、抗炎、保肝護肝和降血糖等作用[5-7]。菌糠是食用菌收獲后的培養(yǎng)基剩余物，我國年產(chǎn)各類菌糠總量約為900萬噸，大部分被作為廢物遺棄。菌糠具有較高的營養(yǎng)價值，是一類優(yōu)質(zhì)的非常規(guī)飼料原料[8]。菌糠飼料的合理開發(fā)與利用既能減少環(huán)境污染，又能緩解我國飼料資源緊缺現(xiàn)狀。菌糠飼料在豬[9]、羊[10]、兔[11]、雞[12]和牛[13]等養(yǎng)殖中都有應(yīng)用。香菇菌糠中殘留大量香菇菌絲體，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素及多糖等生物活性物質(zhì)，與子實體具有相似的生物活性和功能[14-15]。香菇作為大量栽培的食用菌，其菌糠量非常大，但由于香菇菌糠中粗木屑比例高，直接做飼料難以咀嚼和消化，而利用其菌糠提取多糖再應(yīng)用在飼料中，不僅可在產(chǎn)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟中提高附加值，延伸產(chǎn)業(yè)鏈，還可以減少菌糠的廢棄，減少污染，實現(xiàn)經(jīng)濟和生態(tài)效益的雙贏[16-17]。

香菇菌糠多糖的提取方法大多采用傳統(tǒng)的熱水浸提法[18]。近年來，為改善其提取方法，國內(nèi)對香菇多糖的提取工藝進行了深入的研究，主要有酸堿提取法、超聲輔助提取、微波輔助提取、復(fù)合酶輔助提取以及多種方法的聯(lián)用，使提取工藝得到了優(yōu)化，并研究了影響得率的因素[19]。但基于抗氧化活性的復(fù)合酶法提取香菇菌糠多糖的工藝未見報道。本文研究了香菇菌糠多糖的復(fù)合酶法提取工藝及其抗氧化活性，為其進一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇菌糠，大連寶野農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶，江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、檸檬酸、無水乙酸鈉、Tris-HCl溶液、硫酸亞鐵銨溶液、鄰二氮菲、過氧化氫、鄰苯三酚、鹽酸、均為分析純或化學(xué)純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL203電子精密天平：梅特勒-托利多儀器(上海）有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HH-S水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；UV-2800紫外分光光度計：龍尼柯(上海)儀器有限公司；中藥粉碎機：寧波新芝有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵：鞏義市華儀器有限責(zé)任公司；移液槍：賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇菌糠多糖的提取

挑選干燥的香菇菌糠，放入粉碎機中進行粉碎，精確稱取5.0 g粉碎后的香菇菌糠，按照料液比1∶30（mg/ml)加入150 ml的去離子水，按照設(shè)定的酶解條件（pH值、酶解溫度、酶解時間、酶濃度）進行復(fù)合酶解實驗，復(fù)合酶比例為木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶1∶1，然后在85℃的水浴鍋中浸提100 min，得到多糖浸提液，多糖浸提液經(jīng)過濾得到多糖上清液，測定多糖含量。

1.3.2 多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[20]。

多糖提取率（%）=提取出的粗多糖中純多糖量/香菇菌糠原料量×100

1.3.3 多糖提取單因素實驗

準(zhǔn)確稱取粉碎樣品5.0 g，置于三角瓶中，按照料液比1∶30（mg/ml)，加入150 ml的去離子水，將復(fù)合酶[21-22]的條件定為纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶的比例為1∶1∶1，分別考察不同酶解時間（10、20、30、40、50 min）、不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、不同酶解溫度（25、35、45、55、65 ℃）和不同酶濃度（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對香菇菌糠多糖提取率的影響。

1.3.4 香菇菌糠多糖的抗氧化活性

1.3.4.1 清除羥自由基（·OH）活性實驗

取10支10 ml刻度管，均依次加入1 ml的 Tris-HCl溶液(pH值為8.2，0.05 mol/l)，0.3 ml硫酸亞鐵銨(5 mmol/l)和 0.3 ml的鄰二氮菲溶液(7.5 mmol/l)，1號和2號試管不加樣品，3到6號加入1 ml濃度分別0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，7號到10號加入濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的VC溶液，1號試管不加入H2O2（7.5 mmol/l），2到10號試管加入H2O2。定容至刻度。在37℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h，用Tris-HCl溶液調(diào)零，在510 nm下測吸光度A，計算對·OH的清除率。VC做陽性對照，將實驗重復(fù)3次，求平均值。

·OH清除率(%)=(A3-A2)/(A1-A2)×100

式中：A1——體系不加H2O2和多糖(抗氧化劑)的吸光值；

A2——體系加H2O2而不加多糖（抗氧化劑）的吸光值；

A3——體系加入H2O2和多糖(抗氧化劑)的吸光值。

1.3.4.2 抑制超氧陰離子（O2-·）活性實驗

取9支10 ml刻度管，各加入0.05 mol/l Tris-HCl緩沖液4.5 ml，置于25℃水浴中預(yù)熱25 min，1號到4號分別加入0.1 ml濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，5號到8號分別加入濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的VC溶液及0.4 ml鄰苯三酚溶液（0.5 mmol/l），混勻后于25℃水浴中反應(yīng)4 min，加入HCl（8 mol/l）2滴終止反應(yīng)。以Tris-HCl緩沖液調(diào)零，于320 nm處測定吸光度，空白對照組以相同體積的蒸餾水代替。VC做陽性對照。將實驗重復(fù)3次，求平均值。

O2-·清除率（%）=（Ao-Ai）÷Ao×100

式中：Ao——體系未加多糖溶液(抗氧化劑)的吸光值；

Ai——體系加入多糖溶液(抗氧化劑)的吸光值。

1.3.4.3 清除DPPH·效果的測定

取9支試管，1號為空白試管，加入2 ml無水乙醇和2 ml DPPH溶液。2號到5號試管分別加入2 ml濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，四個試管都加入2 ml的DPPH，反應(yīng)0.5 h后在517 nm處測吸光值A(chǔ)i。6號到9號試管分別加入2 ml濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，四個試管都加入2 ml的無水乙醇，反應(yīng)0.5 h后在517 nm處測吸光值A(chǔ)j。VC做陽性對照。將實驗重復(fù)3次，求平均值。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）]/Ac×100

式中：Ai——體系加入DPPH和多糖溶液（抗氧化劑）的吸光值；

Aj——體系加入多糖溶液而未加DPPH的吸光值;

Ac——體系不加入多糖溶液的吸光值。

IC50值指清除率為50%時所需樣品的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶作用時間對香茹菌糠多糖提取率的影響（見圖1）

圖1 酶作用時間對香菇菌糠多糖提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)酶作用時間為50 min時，酶與底物得到充分反應(yīng)，此時香茹菌糠多糖的提取率最高，為9.00%。當(dāng)提取時間大于30 min后，香茹菌糠多糖提取率增加趨于平緩，酶解時間過長，酶的催化活性下降，進而對香茹菌糠多糖提取率影響不大，最佳酶解時間選定為50 min。

2.2 酶作用pH值對香茹菌糠多糖提取率的影響（見圖2）

圖2 pH值對香菇菌糠多糖提取率的影響

由圖2可知，pH值對酶的活性會產(chǎn)生影響，從而影響香茹菌糠多糖的提取率。當(dāng)pH值為3.5時,香菇菌糠多糖的提取率最低，溶液的酸度過大抑制了酶的活性；當(dāng)pH值為5.0時，香菇菌糠多糖提取率達(dá)到9.10%，之后，隨著pH值增大，香茹菌糠多糖的提取率反而減小，這是因為pH值的升高影響了酶與底物的親和力，破壞了酶的活性，從而造成了香茹菌糠多糖提取率的下降。因此，pH值為5.0時最佳。

2.3 酶作用溫度對香茹菌糠多糖提取率的影響（見圖3）

圖3 酶作用溫度對香菇菌糠多糖提取率的影響

由圖3可知，在45℃之前，隨溫度的升高，香茹菌糠多糖提取率不斷增加，在45℃時提取率達(dá)到最大，為9.45%。然后從45℃到65℃隨溫度升高，提取率緩慢下降，可能是由于溫度過高，使酶的活性降低，從而影響香菇菌糠多糖的提取率。因此，選擇復(fù)合酶作用45℃為最佳。

2.4 酶濃度對香菇菌糠多糖提取率的影響(見圖4)

圖4 酶濃度對香菇菌糠多糖提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)酶濃度增加到3%時，香茹菌糠多糖提取率最高約為9.50%，說明在該底物濃度下，酶濃度已經(jīng)趨于飽和，細(xì)胞內(nèi)多糖已溶出，若繼續(xù)添加復(fù)合酶，對香茹菌糠多糖的提取率沒有顯著的影響。因此，酶濃度初步選為3%。

經(jīng)過單因素優(yōu)化獲得復(fù)合酶法輔助提取香菇菌糠多糖適宜條件為：酶解時間50 min，pH值5.0，酶解溫度45℃，酶濃度3%。經(jīng)過驗證試驗，在此提取條件下香菇菌糠多糖的提取率為9.6%。而采用傳統(tǒng)的熱水浸提法提取香菇菌糠多糖，提取率為6.28%，復(fù)合酶法比其提取率提高了52.70%。

2.5 香菇菌糠多糖抗氧化性研究

2.5.1 香菇菌糠多糖對羥自由基（·OH）的清除作用（見圖5）

圖5 香菇菌糠多糖對羥自由基（·OH）的清除作用

由圖5可知，香菇菌糠多糖對羥自由基均具有一定的清除作用。當(dāng)香菇菌糠多糖濃度在0.1～0.7 mg/ml時，清除率趨于穩(wěn)定的上升。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.7 mg/ml時，VC對羥基自由基清除率達(dá)到79.07%，而香菇菌糠多糖對羥基自由基清除率為59.58%。因此，香菇菌糠多糖與VC相比清除能力較弱。香菇菌糠多糖清除·OH的半數(shù)抑制濃度IC50為0.58 mg/ml，VC的IC50為0.34 mg/ml。

2.5.2 香菇菌糠多糖對超氧陰離子(O2-·)的清除作用（見圖6）

圖6 香菇菌糠多糖對超氧陰離子的清除作用

由圖6可知，加入香菇菌糠多糖的體系對鄰苯三酚自氧化所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基具有較明顯的清除作用。當(dāng)香菇菌糠多糖濃度在0.1～0.7 mg/ml之間時，香菇菌糠多糖對超氧陰離子自由基的清除率增加較快。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.7 mg/ml時，VC對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)中所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基清除率達(dá)到79.30%，而香菇菌糠多糖對超氧陰離子自由基清除率為56.80%。香菇菌糠多糖清除(O2-·)的半數(shù)抑制濃度 IC50為 0.60 mg/ml，VC 的IC50為 0.37 mg/ml。

2.5.3 香菇菌糠多糖對DPPH自由基的清除作用（見圖7）

圖7 香菇菌糠多糖對DPPH自由基的清除作用

在DPPH自由基清除實驗中，反應(yīng)時間、光照強度、pH值等因素會對實驗結(jié)果有一些影響，造成粗多糖在不同實驗條件下有不同的抗氧化活性。若條件允許，未來可用高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法等效率高且準(zhǔn)確的實驗方法研究香菇菌糠多糖對抗氧化劑DPPH自由基清除的效果[23-24]。

由圖7可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，香菇菌糠多糖溶液和VC對DPPH自由基清除率不斷增大，香菇菌糠多糖質(zhì)量濃度0.7 mg/ml時，樣品溶液多糖對DPPH自由基清除率達(dá)到41.3%，具有較強清除DPPH自由基的能力，而VC在質(zhì)量濃度為0.7 mg/ml，對DPPH自由基清除率達(dá)到了77.4%，清除DPPH自由基的能力強于香菇菌糠多糖。香菇菌糠多糖清除50%DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50為0.90 mg/ml，VC的IC50為 0.39 mg/ml。

3 結(jié)論

本文通過使用復(fù)合酶解法輔助提取香菇菌糠多糖，得到香菇菌糠多糖的最佳提取工藝為酶解時間50 min，pH值5.0，酶解溫度45℃，酶濃度3%。在此提取條件下香菇菌糠多糖的提取率為9.60%。提取效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水浸提法，提取率提高了52.70%。水浸提法是傳統(tǒng)的提取方法，提取率相對較低，而酶解法具有條件溫和、易去除雜質(zhì)，操作簡單又能保證較高的提取率。因此，用酶解法輔助提取香菇菌糠多糖是高效科學(xué)的，并且適用于實際生產(chǎn)中。

香菇菌糠多糖對羥自由基（·OH）、超氧陰離子(O2-·)和DPPH自由基具有較好的清除作用，并與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。香菇菌糠多糖清除·OH的IC50為0.58 mg/ml，清除 O2-·的 IC50為0.60 mg/ml、清除 DPPH自由基的IC50為0.90 mg/ml。證明了香菇菌糠多糖具有很好的抗氧化作用。