枯草芽孢桿菌B6的特性及其對哺乳期母豬生產(chǎn)性能的影響

■鄭宏臣 甄 杰 鄭 雯 譚 明 徐健勇 宋 詼

（中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室天津工業(yè)生物系統(tǒng)與過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

枯草芽孢桿菌是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用較為廣泛的益生菌[1]?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)屬于革蘭氏陽性、好氧型桿狀細(xì)菌，是公認(rèn)安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)菌株[2]。該菌種在自然界中分布廣泛，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類多，抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣，同時(shí)具有激活免疫、促生長等功能特性，顯示了很好的飼用益生菌的應(yīng)用潛力[3-4]。

微生物來源的胞外多糖具有抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂、提高免疫力等多種生物學(xué)功能[5-7]，如來源于解淀粉芽孢桿菌的胞外多糖能夠抑制胃癌細(xì)胞MC-4和SGC-7901生長活性[8]；來源于解淀粉芽孢桿菌LPL061的多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，其發(fā)酵產(chǎn)率為4.46 g/l[9]；Cellulomonas sp.GJT07 發(fā)酵優(yōu)化后果聚糖產(chǎn)量為15 g/l[10]。

本文以一株高產(chǎn)功能性果聚糖的枯草芽孢桿菌為研究對象，對菌株發(fā)酵產(chǎn)果聚糖的發(fā)酵條件、果聚糖的功能活性，以及該菌株的應(yīng)用特性及其對孕期母豬的飼喂效果進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為開發(fā)一株具有獨(dú)特性能的新型益生菌劑奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及發(fā)酵培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌B6（Bacillus subtilisB6）菌株由本實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分：400 g/l蔗糖、25 g/l可溶性淀粉、5 g/l酵母浸粉、磷酸氫二鉀 1 g/l、氯化鈉10 g/l、氯化鈣0.3 g/l、硫酸鋅0.01 g/l、硫酸亞鐵0.03 g/l、硫酸錳0.1 g/l和硫酸鎂1 g/l。

1.2 液體發(fā)酵

①一級(jí)種子液制備：取甘油管中保存的菌液按照2‰的接種量接種于20 ml LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)10～12 h。

②二級(jí)種子液制備：將一級(jí)種子液按照2%的接種量接種于200 ml LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)10～12 h。

③三級(jí)種子液制備：將二級(jí)種子液接種至5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃、pH值7.0培養(yǎng)至DO上升。

④100 L種子液制備：將三級(jí)種子液接種至100 L發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃、pH值7.0培養(yǎng)。罐壓0.05 MPa，通氣150～300 L/m，初始轉(zhuǎn)速150 r/min。設(shè)定轉(zhuǎn)速串聯(lián)溶氧（40%），最高轉(zhuǎn)速450 r/min。培養(yǎng)至溶氧開始上升，pH值偏堿時(shí)，進(jìn)行移種。

⑤ 1 000 L罐發(fā)酵：配制300 L（滅菌后400 L）發(fā)酵培養(yǎng)基115℃滅菌。將100 L種子液移種至1 000 L發(fā)酵罐中，恒溫37℃、pH值7.0，初始通氣800 L/m（最大為1 500 L/m），初始轉(zhuǎn)速150 r/min（最大轉(zhuǎn)速為350 r/min）。設(shè)定轉(zhuǎn)速串聯(lián)溶氧（30%）。

⑥計(jì)數(shù)與檢測：在發(fā)酵過程中每隔6 h取一份菌液樣品，檢測OD600數(shù)值，以10為梯度分別稀釋至一定倍數(shù)后進(jìn)行平板涂布，放入37℃溫箱培養(yǎng)9 h后計(jì)數(shù)。一份直接涂布，另一份80℃水浴10 min以后再涂布。

1.3 抗氧化能力測定

① ABTS自由基清除能力測試：100 μl樣品溶液與3 000 μl由磷酸鹽緩沖液(10 mmol/l，pH值7.4)稀釋的ABTS自由基溶液(其在734 nm處吸光值為0.70±0.02)快速混勻后，避光反應(yīng)6 min，測定反應(yīng)液在734 nm處的吸光度。按照公式（1）計(jì)算ABTS自由基清除率。

式中：Ablank——空白樣品吸光度；

Asample——測試樣品吸光度。

解淀粉芽孢桿菌果聚糖測試濃度為25 mg/ml。

②DPPH自由基清除能力測試：1 ml樣品溶液、1 ml由無水乙醇配制0.2 mmol/l的DPPH溶液和1 ml二次水快速混勻后，避光反應(yīng)30 min，測定反應(yīng)液在517 nm處的吸光值。按照公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Ablank——空白樣品吸光度；

Asample——測試樣品吸光度。

③鐵還原能力測試：取100 μl樣品溶液與3 ml鐵還原(FRAP)試劑混勻后于37℃水浴中反應(yīng)5 min，測定593 nm處吸光值。同時(shí)取濃度0～1.0 mmol/l的FeSO4溶液各100 μl代替樣品反應(yīng)，以593 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品對應(yīng)的FeSO4濃度，表示鐵還原能力。

1.4 孕期母豬飼喂實(shí)驗(yàn)

選擇胎次接近、健康狀況良好的長白哺乳母豬48頭，平均分成兩組，每組24頭，實(shí)驗(yàn)從產(chǎn)仔前30 d至哺乳仔豬22日齡斷奶結(jié)束，對照組為基礎(chǔ)日糧，益生組每日添加1 mlB.subtilisB6液體菌劑。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌B6液體發(fā)酵高產(chǎn)果聚糖

前期研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B6發(fā)酵過程中可產(chǎn)生具有良好生物活性的功能多糖，并鑒定其主要成分為果聚糖。本文通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解不同碳源對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)功能性低碳的影響，分別以400 g/l的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，其他成分不變。以2%的接種量于 37℃、200 r/min條件下培養(yǎng) 24 h，結(jié)果如表1所示，B.subtilisB6發(fā)酵高效生產(chǎn)果聚糖需以蔗糖為主要的培養(yǎng)基成分，應(yīng)用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件，發(fā)酵培養(yǎng)24 h枯草芽孢桿菌活菌數(shù)達(dá)到1×1010～1×1011CFU/ml，發(fā)酵液中功能多糖（果聚糖）含量≥100 g/l。如此高的果聚糖產(chǎn)量在枯草芽孢桿菌中并不多見，也正是由于其高產(chǎn)功能多糖的代謝特性，使得B.subtilisB6顯示了良好的益生菌活性。

表1 不同碳源對B.subtilisB6發(fā)酵產(chǎn)果聚糖的影響（g/l）

2.2 枯草芽孢桿菌果聚糖的抗氧化活性

據(jù)報(bào)道果聚糖作為功能性多糖，通常具有抗氧化和抗腫瘤等生物學(xué)活性，本文應(yīng)用DPPH自由基清除、ABTS自由基清除與鐵還原能力指標(biāo)來評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌B6所產(chǎn)果聚糖的抗氧化活性。結(jié)果如表2所示，隨枯草芽孢桿菌B6果聚糖濃度的提高，其抗氧化能力隨之增強(qiáng)，當(dāng)果聚糖濃度達(dá)到10 mg/ml，其DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分別達(dá)到80%和70%以上，鐵還原能力也達(dá)到抗氧化劑組鐵還原能力的69.6%?？梢姡莶菅挎邨U菌B6果聚糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，作為益生菌產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物，對于清除動(dòng)物體內(nèi)自由基、提高免疫力、改善體質(zhì)、提高抗病性將具有顯著效果。

表2 枯草芽孢桿菌B6果聚糖抗氧化能力測定結(jié)果

2.3 枯草芽孢桿菌B6的應(yīng)用特性

本文對B.subtilisB6的主要應(yīng)用性能指標(biāo)進(jìn)行了詳細(xì)測定，結(jié)果見表3所示，經(jīng)過分析，枯草芽孢桿菌B6具有活菌數(shù)高，菌種性能強(qiáng)，生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)勢。同時(shí)，該菌株在生長過程中可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類，可加強(qiáng)宿主體內(nèi)的營養(yǎng)代謝。作為益生菌應(yīng)用，B.subtilisB6也顯示了良好的抗胃酸和耐高溫等抗逆性能，其保存穩(wěn)定及有效性也很優(yōu)秀，因此，B.subtilisB6顯示了非常良好的益生菌劑開發(fā)應(yīng)用潛力。

2.4 枯草芽孢桿菌B6對母豬繁殖及育仔性能的影響

應(yīng)用B.subtilisB6液體菌劑飼喂哺乳期母豬，結(jié)果如表4所示，與對照組相比，飼喂B.subtilisB6液體菌劑的母豬生產(chǎn)平均健仔數(shù)相對高，弱仔及死胎率相對低，平均窩重提高了28.8%，說明該益生菌劑對母豬生產(chǎn)具有顯著的有益效果；同時(shí)，平均斷奶窩重也較對照組提高了18%，通過觀察，飼喂益B.subtilisB6液體菌劑的仔豬精神相對較好，顯著緩解仔豬腹瀉，可見B.subtilisB6液體菌劑具有顯著提高母豬及仔豬免疫力的功效。

3 結(jié)論

本文針對一株高產(chǎn)果聚糖的枯草芽孢桿菌B6及其應(yīng)用做了系統(tǒng)研究，該菌株作為飼用益生菌劑可產(chǎn)生功能性果聚糖作為良好的抗氧化劑，可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力和抗病性。菌株在生長過程中還可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類，可加強(qiáng)宿主體內(nèi)的營養(yǎng)代謝。應(yīng)用該活體菌劑飼喂孕期母豬，可顯著提高窩重，仔豬精神相對更好，顯著緩解仔豬腹瀉，顯著提高母豬及仔豬免疫力。可見，枯草芽孢桿菌B6具有良好的益生菌開發(fā)潛力。

表3B.subtilisB6主要應(yīng)用性能指標(biāo)

表4B.subtilisB6液體菌劑對母豬繁殖及育仔性能的影響