三贊膠降解菌的篩選鑒定及降解產(chǎn)物的抗氧化活性分析

程斌，李曉雁，潘奕臣，馮雪，黃海東，通信作者

三贊膠降解菌的篩選鑒定及降解產(chǎn)物的抗氧化活性分析

程斌1，李曉雁2，潘奕臣1，馮雪1，黃海東1，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

篩選得到3株三贊膠降解菌，可在以三贊膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生降解圈，多項分類鑒定結(jié)果表明，降解菌JD05和JD08分別為熒光假單胞菌和巨大芽胞桿菌，降解菌SZJ01為煙曲霉。3株降解菌協(xié)同作用，37 ℃處理72 h，三贊膠溶液粘度下降79.6%，多糖分子量降低為2個不同分子量分布的組分，重均分子量分別為1.9×104Da和3.7×103Da，經(jīng)生物降解處理后，三贊膠多糖降解產(chǎn)物的抗氧化活性提高，清除羥自由基和超氧陰離子的IC50分別為3.8 mg/mL和2.6 mg/mL。

三贊膠；多糖；降解菌；分子量；抗氧化活性

鞘氨醇單胞菌屬的菌株能合成多種微生物多糖產(chǎn)物[1-2]，例如結(jié)冷膠（gellan gum，S-60）、溫輪膠（welan gum，S-130）、鼠李膠（rhamsangum，S-194）、定優(yōu)膠（diutan gum，S-657）等，這些多糖主鏈結(jié)構(gòu)相對保守，為-X-葡萄糖-葡萄糖醛酸-葡萄糖-X-，X是鼠李糖或甘露糖，但側(cè)鏈基團(tuán)種類和連接方式各有不同，使每種多糖產(chǎn)物具有各自獨特的物理學(xué)性能[3]。三贊膠（Sanxan）又稱為鞘氨醇膠Ss，是鞘氨醇單胞菌屬菌株合成的一個新多糖品種，其合成菌三贊鞘氨醇單胞菌（）是鞘氨醇單胞菌屬的新種[4]。三贊膠多糖由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖和鼠李糖組成，其主鏈結(jié)構(gòu)為-4-β-D-Man- 1-4-β-D-GlcA-1-3-α-L-Rha-1-3-β-D-Glc，三贊膠具有增稠和假塑性能，其溶液加熱冷卻后，能形成螺旋纏繞結(jié)構(gòu)的彈性凝膠，具有耐酸耐高溫性能[5-6]，近期已通過專家評審委員會的技術(shù)審查，作為增稠劑、穩(wěn)定劑和凝固劑用于食品領(lǐng)域[7]。

三贊膠是由4種不同單糖分子組成的雜多糖，分子量在106Da以上，具有螺旋纏繞的二級結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性好，對淀粉酶、纖維素酶、酸堿等具有抗性[8]。這種穩(wěn)定性在產(chǎn)物應(yīng)用時的抗溫抗酸堿方面具有明顯優(yōu)勢，但也存在一些弊端，例如這類高分子聚合物在環(huán)境中大量釋放后，難以降解從而造成環(huán)境污染。而且，高分子量的多糖分子活性功能基團(tuán)被包裹在分子內(nèi)部，難以進(jìn)入生物體細(xì)胞內(nèi)，抗氧化等生物學(xué)活性較低。對多糖進(jìn)行降解可以提高其抗氧化活性，得到的寡糖產(chǎn)品具有抑菌、抗病毒、提高免疫力等功能，可以提高產(chǎn)品的應(yīng)用價值[9]。國內(nèi)外對微生物多糖的生物降解進(jìn)行了大量研究，特別是黃原膠的降解[10-12]，但是關(guān)于三贊膠生物降解的研究還未見報道。

本研究分離得到3株具有協(xié)同降解效果的菌株JD05、JD08和SZJ01，對降解菌進(jìn)行了多相分類鑒定，并研究了三贊膠生物降解產(chǎn)物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 菌種

三贊膠合成菌由本實驗室保藏，菌株JD05、JD08和SZJ01為本研究篩選并保藏。

1.2 材料與試劑

鄰二氮菲、Tris-HCl、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3等均為分析純；窄分布葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品購自中國計量科學(xué)研究院；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、pGM-T克隆試劑盒均購自天根公司；真菌基因組 DNA 提取試劑盒購自天津蘭瑞公司；PCR 主要試劑購自潤泰公司。

1.3 培養(yǎng)基

三贊膠降解菌富集培養(yǎng)基（g/L）：三贊膠10，酵母粉0.2。

三贊膠降解菌篩選培養(yǎng)基（g/L）：三贊膠10，酵母粉0.2，瓊脂15。

R2A培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖0.5，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，可溶性淀粉0.5，酸水解酪素0.5，磷酸氫二鉀0.3，丙酮酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，瓊脂15，pH 7.2±0.2。

但這并沒有阻止人們拯救洛麗塔的決心，人們擁向海洋館，手里拿著一面自制的旗幟，呼吁游客抵制觀看洛麗塔的表演，“它已經(jīng)很累了，難道我們要為滿足自己欲望讓它無休止地演出嗎？”

改良馬丁培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉2，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.5，瓊脂15，pH 6.4±0.2。

1.4 試驗方法

1.4.1 三贊膠的制備

按照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行菌株的發(fā)酵和三贊膠的制備。

1.4.2 三贊膠降解菌的富集

取天津市紀(jì)莊子污水處理廠曝氣池活性污泥，加入100 mL三贊膠降解菌富集培養(yǎng)基中，28、32和37 ℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d；選擇降解效果較好的培養(yǎng)溫度，在此溫度下，取降解液按10%的接種量再次轉(zhuǎn)接到三贊膠降解菌富集培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)5 d，反復(fù)傳代富集三贊膠降解菌，直至5 d內(nèi)溶液粘度降至6 r/min條件下300 mPa·s以下，以此時的降解液作為下一步篩選菌種的樣品。

1.4.3 三贊膠降解菌的篩選與分離純化

用1 mL三贊膠降解液，使用無菌水倍比稀釋后，取100 μL涂布于三贊膠篩選培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)，挑取有明顯降解圈的菌落，將降解菌中的細(xì)菌和霉菌分別劃線接種于R2A和改良馬丁平板培養(yǎng)基上，選擇單菌落進(jìn)行分離純化，再轉(zhuǎn)接于三贊膠篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行驗證。

按參考文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行菌種的形態(tài)學(xué)觀察，氧化酶活性、過氧化氫酶活性、硝酸鹽還原、葡萄糖氧化發(fā)酵、產(chǎn)H2S、淀粉水解、甲基紅試驗等生理生化特征測定。

1.4.5 降解菌的分子鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

提取菌株的基因組DNA，細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物為27 F（5＇-GAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3＇）和1 541 R（5＇-TACGGCTACCTTG TTACGACTT-3＇）[10]，真菌ITS序列的PCR擴(kuò)增引物為ITS1（5＇-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA-3＇）和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3＇），nLSU的PCR擴(kuò)增引物為LROR（5＇-AC CCGCTGAACTTAAGC-3＇）和LR7（5＇-TACTACC ACCAAGA TCT-3＇），SSU的PCR擴(kuò)增引物為NS1（5＇-GTAG TCATATGCTTGTCTC -3＇）和NS8（5＇-TCCGCA GGTTCACCTACGGA-3＇）。擴(kuò)增得到目的基因片斷后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，與pGM-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，在含 IPTG和X-Gal的LB平板上37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落，驗證并送北京奧科鼎盛公司測序。將得到的16S rDNA、ITS、nLSU和SSU測序結(jié)果與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對，得到與降解菌株序列同源性最高的序列，使用軟件ClustalX 1.8對得到的核苷酸序列進(jìn)行分析，得到序列間的相似值。利用軟件 MEGA 6.0計算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[15]。

1.4.6 三贊膠和降解液的粘度檢測

取100 mL樣品溶液，利用Brookfield R/S Plus旋轉(zhuǎn)流變儀，選擇cc40轉(zhuǎn)子，在25 ℃下測定樣品溶液在6 r/min剪切速率下的粘度。

1.4.7 降解處理后多糖產(chǎn)物的分離純化

取100 mL 經(jīng)降解處理后的三贊膠溶液，稀釋10倍后，90 ℃加熱30 min，冷卻后1 3000 r/min離心30 min后棄沉淀，反復(fù)離心4～6次，直至上清液鏡檢無菌體細(xì)胞，Sevag法除蛋白后，加入5倍體積的無水乙醇沉淀多糖，放入截留分子量3 500的透析袋中，去離子水透析48 h，冷凍干燥備用。

1.4.8 樣品的分子量測定

將凍干后的多糖樣品重新用ddH2O溶解，用島津LC-20A凝膠滲透色譜儀分析多糖樣品的重均分子量、數(shù)均分子量和分子量分布指數(shù)（Polydispersity index，PDI），用葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，色譜柱為Agilent PL aquagel-OH MIXED 8μm column，示差折光檢測器；流動相使用ddH2O，流速1.0 mL/min，柱溫36 ℃，進(jìn)樣體積20 μL。

1.4.9 三贊膠降解物的單糖組成分析

稱取5 mg多糖樣品，加入2 mol/L三氟乙酸1.5 mL，120 ℃水解4 h，水解后的樣品置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中干燥，完全蒸干后加入3 mL甲醇40 ℃旋蒸干燥，重復(fù)3次。加入1 mL超純水溶解，按照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行PMP柱前衍生化。PMP衍生化的水解樣品和葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品按下述方法進(jìn)行HPLC分析：色譜柱為Unitary C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為乙腈和0.05 mol/L pH 6.8的磷酸緩沖液（∶＝18∶82），流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，紫外檢測波長為250 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4.10 抗氧化活性的測定

樣品羥自由基清除率、超氧陰離子清除率和還原力的測定按照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 三贊膠降解菌的篩選與降解效果

將活性污泥樣品加入三贊膠降解菌富集培養(yǎng)基中，不同溫度富集培養(yǎng)7 d，結(jié)果表明在37 ℃培養(yǎng)10 d后粘度下降。將發(fā)生降解的樣液轉(zhuǎn)接，反復(fù)傳代富集三贊膠降解菌群，得到的降解液在37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)5 d，可以將樣液的粘度由2 780 mPa·s降至145 mPa·s（圖1）。

圖1 不同菌株對三贊膠的降解效果

將富集到的降解液稀釋涂布三贊膠篩選培養(yǎng)基平板，得到的菌株SZJ01可以產(chǎn)生明顯的降解圈，JD05和JD08協(xié)同作用也可以產(chǎn)生降解圈（圖2、圖3）。將菌株JD05、JD08和SZJ01分別在R2A和改良馬丁培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，制成107CFU/mL的菌液，以10%的接種量接入三贊膠降解培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3 d后，溶液粘度分別下降51.3%、35.0%和17.9%；將3種菌株的發(fā)酵液混合后，相同條件下，三贊膠溶液的粘度下降79.6%，說明3種株菌對三贊膠溶液具有明顯的協(xié)同降解作用。但繼續(xù)延長處理時間，混合菌5 d處理后，仍無法將三贊膠完全降解。

圖2 菌株SZJ01的三贊膠降解圈

圖3 菌株JD05和JD08的三贊膠降解圈

2.2 三贊膠降解菌的鑒定

菌株JD05在R2A平板上的菌落為黃綠色，革蘭氏陰性，桿狀，細(xì)胞大小（0.5～0.7）μm×（1.3～1.9）μm，氧化酶、接觸酶、脲酶、檸檬酸鹽利用和明膠水解呈陽性，硝酸鹽還原，H2S產(chǎn)生，吲哚產(chǎn)生，甲基紅試驗和V-P試驗呈陰性。測序得到長度為1 522 bp菌株JD05的16S rDNA序列，在GenBank中的序列登記號為MK240500，經(jīng)BLAST比對和MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明JD05屬于假單胞菌屬（），與AE1的同源性為99.5%。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定結(jié)構(gòu)，確定菌株JD05為熒光假單胞菌。

圖4 菌株JD05的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

菌株JD08在R2A平板上的菌落為白色，革蘭氏陽性，桿狀，細(xì)胞（1.2～1.5）μm×（2.8～3.6）μm，中生芽孢，氧化酶、接觸酶、脲酶、明膠水解、硝酸鹽還原和V-P試驗呈陽性，H2S產(chǎn)生，吲哚產(chǎn)生，甲基紅試驗和檸檬酸鹽利用呈陰性。菌株JD08的16S rDNA序列長度為1 449 bp，在GenBank中的序列登記號為MK240499，進(jìn)行BLAST比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖5），結(jié)果表明JD08屬于芽孢桿菌屬（），與DSM 32的同源性為98.9%。綜合多種分類鑒定結(jié)果，確定菌株JD08為巨大芽孢桿菌。

圖5 菌株JD08的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

菌株SZJ01在改良馬丁培養(yǎng)基上形成的菌落表面絨毛狀，灰白色菌絲上有墨綠色孢子，菌絲的頂端膨大形成球形孢囊，孢囊表面可輻射生出一層孢子梗，分生孢子為球形，直徑（1.2～1.4）μm。菌株SZJ01的ITS、LSU和SSU序列長度分別為613、1 304和1 676 bp，在GenBank中的序列登記號分別為MK240371，MK240373和MK240374?；贗TS、LSU和SSU序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，菌株SZJ01屬于曲霉屬（），與在同一個分支簇（圖6），根據(jù)BLAST比對，菌株SZJ01的ITS、LSU和SSU序列與的同源性分別為99.6%、100.0%和99.8%，結(jié)合形態(tài)學(xué)指標(biāo)鑒定，確定其為煙曲霉。

圖6 菌株SZJ01基于ITS、LSU和SSU序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 三贊膠的降解產(chǎn)物分析

用葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)的多糖分子量計算回歸方程為：Log（）＝11.061-0.736t，為重均分子量，t為保留時間（min），相關(guān)系數(shù)為0.998 7。凝膠滲透色譜檢測表明，三贊膠的重均分子量為5.4×106Da，聚合物分散指數(shù)（PDI，Polymer dispersity index）為1.18。經(jīng)富集降解菌處理，三贊膠被完全降解，未分離純化到多糖組分。菌株JD05、JD08和SZJ01處理后的三贊膠樣品，多糖分子量分布變寬，沒有明顯的多糖主峰。3株降解菌聯(lián)合降解三贊膠溶液3 d后，可分離得到2個多糖組分，分子量分別為1.9×104和3.7×103（圖7）。經(jīng)PMP衍生和HPLC檢測，在降解液中可檢測到葡萄糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖，用三氟乙酸水解多糖樣品，進(jìn)而分析其單糖組成，發(fā)現(xiàn)經(jīng)3種降解菌協(xié)同作用后，三贊膠由葡萄糖、葡萄糖醛酸和甘露糖組成，鼠李糖組分完全降解。

圖7 三贊膠及降解物的凝膠滲透色譜

注：A為三贊膠多糖；B為3株降解菌聯(lián)合降解后的三贊膠多糖

為驗證3株降解菌產(chǎn)生水解酶對三贊膠的降解作用，在三贊膠發(fā)酵液中分別加入降解菌的上清液，透射電子顯微鏡觀察降解菌水解酶對三贊膠的影響。從圖8A可以看出，三贊膠合成菌在發(fā)酵過程中向胞外分泌纖毛狀多糖，但并不從細(xì)胞上脫離，說明三贊膠是一種典型的胞壁多糖，菌株JD05產(chǎn)生的水解酶可以將三贊膠從細(xì)胞上分離下來（圖8B），視野中能看到脫落的多糖分子（圖8C）。而另外2株降解菌，未觀察到其對三贊膠合成過程的影響，推測菌株JD05產(chǎn)生的水解酶可能對三贊膠多糖有解聚作用，或可以影響多糖的高級結(jié)構(gòu)，但由于三贊膠是一種高分子雜多糖，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大，靠單一降解菌的水解酶無法徹底將其降解。

圖8 降解菌對三贊膠合成影響的透射電鏡觀察（×7 000）

注：A為三贊膠合成菌；B為JD05上清液處理后的三贊膠合成菌；C為脫落的三贊膠多糖

2.4 三贊膠降解產(chǎn)物的抗氧化活性分析

將三贊膠和經(jīng)降解菌處理的多糖樣品純化，進(jìn)行抗氧化活性測定，結(jié)果如圖9所示，可以看出經(jīng)生物降解處理的樣品，三項抗氧化活性指標(biāo)均高于對照的三贊膠多糖，且隨多糖分子量的降低，樣品的抗氧化活性提高，經(jīng)菌株JD05、JD08和SZJ01處理后的多糖樣品還原力最高，A700達(dá)到0.693；對羥自由基和超氧陰離子的清除率分別達(dá)到67.6%和73.5%。三贊膠清除羥自由基的IC50為17.7 mg/mL，清除超氧陰離子的IC50為13.6 mg/mL；經(jīng)3種菌協(xié)同降解后，三贊膠的抗氧化活性明顯提高，清除羥自由基和超氧陰離子的IC50分別為3.8和2.6 mg/mL。

圖9 三贊膠及生物降解后多糖的抗氧化活性

3 結(jié)論

本文富集得到可以將三贊膠完全降解的混合菌群，從而解決了三贊膠環(huán)境釋放后的環(huán)保問題，實現(xiàn)了高分子多糖推廣應(yīng)用“進(jìn)可攻，退可守”的要求[17]。分離篩選到3株在以三贊膠為唯一碳源的平板上生長的降解菌JD05、JD08和SZJ01，多相分類鑒定結(jié)果表明其分別為熒光假單胞菌、巨大芽胞桿菌和煙曲霉。3株降解菌協(xié)同作用，可將三贊膠溶液的粘度降低79.6%，同時三贊膠多糖的重均分子量由5.4×106Da降低為1.9×104Da和3.7×103Da。隨著分子量的降低，三贊膠多糖降解產(chǎn)物的抗氧化活性明顯提高，本研究為拓展三贊膠多糖的應(yīng)用范圍提供了數(shù)據(jù)支持。

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Screening, identification of sanxan-degrading microorganisms and antioxidant activities of degradation product

CHENG Bin1, LI Xiao-yan2, PAN Yi-chen1, FENG Xue1, HUANG Hai-dong1,Corresponding Author

（1. College of Agronomy & Resources and Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Sanxan-degrading strains were screened, which formed degrading band on medium plate with sanxan as the only carbon source. On the basis of polyphasic taxonomic study, strain JD05, JD08 and SZJ01 were considered to be,and. Treated by the mixture fermentation liquid of these three strains with the temperature of 37 ℃ and 72 h, the viscosity of sanxan solution decreased by 79.6%. The molecular weight of polysaccharide was reduced to two components with different molecular weight distributions, with 1.9×104Da and 3.7×103Da, respectively. The antioxidant activity of sanxan degradation product increased, with the IC50of scavenging hydroxyl free radical 3.8 mg/mL and the IC50of scavenging superoxide anion 2.6 mg/mL, respectively.

sanxan; polysaccharide; degrading microorganisms; molecularweight; antioxidant activity

1008-5394（2019）04-0043-06

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.009

Q939.97

A

2019-04-03

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201810061001）；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201910061068）；國家自然科學(xué)基金（31571790）

程斌（1997-），男，本科在讀，研究方向：生物技術(shù)。E-mail：153900910@qq.com。

黃海東（1972-），男，教授，博士，研究方向：資源與應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail：hdhuang@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：張愛婷