二維相關(guān)譜技術(shù)在熒光譜重疊峰解析中的應(yīng)用

張婧，柳春雨，連增艷，楊延榮，孫國(guó)紅，楊仁杰

二維相關(guān)譜技術(shù)在熒光譜重疊峰解析中的應(yīng)用

張婧，柳春雨，連增艷，楊延榮，孫國(guó)紅，楊仁杰通信記者

（天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，環(huán)境中的多環(huán)芳烴殘留量低、種類繁多，常規(guī)熒光光譜法難以對(duì)復(fù)雜體系中的多環(huán)芳烴重疊熒光峰進(jìn)行有效解析。采用二維熒光相關(guān)譜方法對(duì)苯并[a]芘、苯并[ghi]苝、苯并[k]熒蒽三種多環(huán)芳烴的混合溶液進(jìn)行熒光峰解析。配置三種多環(huán)芳烴混合溶液，共30個(gè)樣本，并采集其隨濃度變化的一維動(dòng)態(tài)熒光譜。在此基礎(chǔ)上，以濃度為外擾，分別對(duì)動(dòng)態(tài)熒光譜進(jìn)行同步和異步二維相關(guān)譜計(jì)算。以一維熒光光譜圖中未被覆蓋的500 nm苯并[ghi]苝熒光峰為線索，根據(jù)同步譜中交叉峰的正負(fù)和異步譜中交叉峰的有無(wú)，推斷出405、425、459和491 nm處的熒光峰來自于苯并[a]芘；471、480和500 nm處的熒光峰來自于苯并[ghi]苝；417、433和443 nm處的熒光峰來自于苯并[k]熒蒽。研究結(jié)果表明，二維熒光相關(guān)譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中多種多環(huán)芳烴重疊熒光峰的有效解析，能夠提供更多的光譜特征信息。

二維熒光相關(guān)譜技術(shù)；苯并[a]芘；苯并[ghi]苝；苯并[k]熒蒽；重疊峰；解析

多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)以稠環(huán)或非稠環(huán)形式相連接的烴類化合物[1]，大部分PAHs具有致癌性、致畸性和致突變性，是重要的環(huán)境和食品污染物。環(huán)境中的PAHs主要來源于化石燃料的燃燒等人類活動(dòng)，石油開采、石化產(chǎn)品的生產(chǎn)和運(yùn)輸過程也會(huì)造成環(huán)境中的PAHs污染[2]。PAHs在環(huán)境中的殘留量比較低，但是分布較廣泛，能以氣態(tài)或顆粒態(tài)存在于大氣、水體、土壤和植物中。對(duì)環(huán)境中PAHs的檢測(cè)已受到很多專家的重視。鑒于PAHs是具有多個(gè)苯環(huán)的閉合共軛結(jié)構(gòu)，熒光產(chǎn)生效率較高[3]，可使用熒光光譜分析法對(duì)PAHs進(jìn)行檢測(cè)。但在成分復(fù)雜的體系中，多環(huán)芳烴熒光峰重疊嚴(yán)重，常規(guī)熒光光譜法不能對(duì)其進(jìn)行有效解析。二維熒光相關(guān)譜技術(shù)將光譜信號(hào)擴(kuò)展到二維上，可對(duì)含有重疊峰的復(fù)雜光譜進(jìn)行簡(jiǎn)化，極大地提高了光譜分辨率。并且這種技術(shù)能提供各信號(hào)峰之間變化的相關(guān)關(guān)系，有利于研究分子內(nèi)和分子間的相互作用[4]。

二維相關(guān)技術(shù)最早于1986年由Noda提出[5]。2000年，Nakashima等率先將二維相關(guān)技術(shù)與熒光光譜法結(jié)合，對(duì)PAHs混合溶液的熒光特性進(jìn)行了研究，指出該技術(shù)可以對(duì)PAHs重疊峰進(jìn)行分辨[6-7]。2003年，Nakashima等[8]又利用二維熒光相關(guān)譜技術(shù)對(duì)膠束溶液中蒽和芘衍生物進(jìn)行光譜分析，結(jié)果表明當(dāng)在二維熒光相關(guān)光譜中采用猝滅擾動(dòng)時(shí)，異步譜可有效增強(qiáng)光譜分辨率。國(guó)內(nèi)對(duì)于此技術(shù)的研究也取得了較好的成果，利用二維熒光相關(guān)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多組份多環(huán)芳烴混合溶液中重疊熒光峰的解析[9-11]。此外，Yang等[12]提出了一種基于二維熒光相關(guān)譜定量檢測(cè)環(huán)境中多環(huán)芳烴的新方法，并取得較好的分析結(jié)果。

本文采用二維熒光相關(guān)譜方法，以濃度為外擾，構(gòu)建苯并[a]芘、苯并[ghi]苝、苯并[k]熒蒽混合溶液的同步和異步二維熒光相關(guān)譜，根據(jù)同步譜中交叉峰的正負(fù)和異步譜中交叉峰的有無(wú)，對(duì)3種多環(huán)芳烴的重疊峰進(jìn)行解析。該研究不僅為PAHs特征熒光信息庫(kù)的建立提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為復(fù)雜體系中多種多環(huán)芳烴的同時(shí)分析提供一種可行性方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)所用儀器為美國(guó)Perkin Elmer公司生產(chǎn)的LS-55型號(hào)熒光分光光度計(jì)，以脈沖氙燈為光源。采用1 cm具塞石英比色皿。掃描條件：激發(fā)狹縫10.0 nm，發(fā)射狹縫10.0 nm，掃描速度1 000 nm/min，光電倍增管電壓700，濾波器350 nm cut-off。選取350～580 nm波段范圍掃描樣品的熒光光譜。

試驗(yàn)所用3種試劑均由Accu Standard廠家提供，以乙腈為溶劑的苯并[a]芘溶液，濃度為100 mg/L；以丙酮為溶劑的苯并[ghi]苝溶液，濃度為100 ug/mL；以甲醇為溶劑的苯并[k]熒蒽溶液，濃度為100 ug/mL，純度均為分析純。

1.2 樣品配置

采用逐步稀釋法，將苯并[a]芘、苯并[ghi]苝、苯并[k]熒蒽3種試劑分別用超純水稀釋成濃度為1×10g/L的儲(chǔ)備液于容量瓶中備用。移取不同量的3種單組份儲(chǔ)備液和一定量的超純水混合，配置成3種混合溶液體系，共30個(gè)樣品。樣品No.1～No.9組成體系一，苯并[ghi]苝濃度遞減（5×10-5～6×10-6g/L），苯并[a]芘、苯并[k]熒蒽濃度遞增（5×10-6～4×10-5g/L）；樣品No.10～No.18組成體系二，苯并[k]熒蒽濃度遞增（1×10-6～3×10-5g/L），苯并[a]芘、苯并[ghi]苝濃度遞減（3×10-5～1×10-6g/L）；樣品No.19～No.30組成體系三，苯并[a]芘濃度遞減（5×10-5～6×10-6g/L），苯并[ghi]苝、苯并[k]熒蒽濃度遞增（5×10-6～4×10-5g/L）。

1.3 二維熒光相關(guān)譜計(jì)算

假設(shè)原始常規(guī)一維熒光光譜（×）包含個(gè)光譜，根據(jù)二維相關(guān)Noda理論[13-15]，基于式（1）和（2）進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，可分別得到同步和異步二維相關(guān)譜矩陣（ν1, ν2）和（ν1, ν2）。

式中為階方陣，即為Hilbert-Noda矩陣，其矩陣元為

2 結(jié)果與分析

圖1是濃度為1×10-5g/L的3種單組份多環(huán)芳烴水溶液的一維熒光光譜圖。苯并[a]芘有3個(gè)熒光峰，分別在405、425和459 nm處；苯并[ghi]苝有2個(gè)熒光峰，分別在471和500 nm處；苯并[k]熒蒽有2個(gè)熒光峰，分別在417和433 nm處。圖2是3種多環(huán)芳烴的混合溶液（濃度均為1×10-5g/L）在238 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下的一維熒光光譜圖。除了苯并[ghi]苝在500 nm處的肩峰可以分辨出來之外，3種多環(huán)芳烴的其他熒光峰都被覆蓋或淹沒。因此，常規(guī)熒光光譜法無(wú)法有效區(qū)分出3種多環(huán)芳烴的特征峰。

圖1 單組份多環(huán)芳烴一維熒光光譜圖

圖2 混合溶液一維熒光光譜圖

對(duì)混合溶液體系一的9個(gè)樣品，以濃度為外擾，以平均譜為參考譜，根據(jù)公式（1）和公式（2）分別進(jìn)行同步和異步二維熒光相關(guān)譜計(jì)算，得到體系一的同步（圖3a）和異步（圖3b）二維熒光相關(guān)譜，圖3c是異步譜在425 nm處的切譜。

圖3a 體系一同步譜

圖3b 體系一異步譜

圖3c 體系一異步425 nm處切譜

對(duì)于同步二維熒光相關(guān)譜，在主對(duì)角線405、425、471、480和500 nm處存在自相關(guān)峰，表明此波長(zhǎng)處的熒光峰強(qiáng)度隨外擾的變化而變化。在主對(duì)角線外側(cè)（500，480）、（500，471）nm處存在正交叉峰，表明3個(gè)熒光峰強(qiáng)度隨外擾變化方向相同，其可能來自混合溶液中的同一組份。由于混合溶液中苯并[ghi]苝濃度在減小，苯并[a]芘和苯并[k]熒蒽濃度在增大，再結(jié)合500 nm處苯并[ghi]苝的峰（未被覆蓋），可推斷480和471 nm處的熒光峰也來自混合溶液中的苯并[ghi]苝；在（480，405）和（480，425）nm處存在負(fù)的交叉峰，表明405和425 nm處的熒光峰強(qiáng)度隨外擾的變化方向與480 nm處變化方向相反，表明405和425 nm處熒光峰可能來自混合溶液中的苯并[a]芘或苯并[k]熒蒽。

對(duì)于異步二維熒光相關(guān)譜，在（500，480）、（500，471）nm處不存在交叉峰，表明3個(gè)熒光峰強(qiáng)度隨外擾變化的速率相等，進(jìn)一步證實(shí)了471、480和500 nm處熒光峰來自同一組份，都來自混合溶液的苯并[ghi]苝；（471，405）、（471，417）、（471，425）、（471，433）、（471，459）和（471，491）nm處存在交叉峰，表明471 nm處熒光峰強(qiáng)度與405、417、425、433、459和491 nm處熒光峰強(qiáng)度變化速率不同，表明471 nm處的熒光峰與其他6個(gè)峰的來源不同，由于471 nm處的峰來自苯并[ghi]苝，可推測(cè)405、417、425、433、459和491 nm處熒光峰來自混合溶液中的苯并[a]芘或苯并[k]熒蒽。此外，（491，433）和（491，443）nm處的交叉峰表明，491 nm處的熒光峰與433和443 nm處峰的來源不同。從圖3c異步譜425 nm處切譜上可以看到，425 nm與417、433、471和500 nm之間都存在交叉峰，而425 nm與405、459 nm之間不存在交叉峰，可推測(cè)417和433 nm處熒光峰來源相同，405、425和459 nm處熒光峰來源相同，但對(duì)于具體來源還需要進(jìn)一步分析。

對(duì)于體系二動(dòng)態(tài)光譜進(jìn)行同步和異步相關(guān)計(jì)算。對(duì)于同步二維熒光相關(guān)譜（圖4a），在主對(duì)角線405、471和500 nm處存在自相關(guān)峰。主對(duì)角線外側(cè)存在一些正交叉峰，分別位于（471，405）、（471，425）和（471，500）nm處，表明405、425、500 nm處與471 nm處的熒光峰強(qiáng)度隨外擾的變化方向相同。由于該混合溶液體系中苯并[ghi]苝和苯并[a]芘的濃度在減小，苯并[k]熒蒽的濃度在增大，再結(jié)合上述分析結(jié)果（471和500 nm峰來自苯并[ghi]苝，且與405和425 nm峰來源不同），可推測(cè)出405和425 nm處的熒光峰來自于混合溶液中的苯并[a]芘。因405、425和459 nm處熒光峰來源相同，推測(cè)459 nm處峰也來自苯并[a]芘。

對(duì)于異步二維熒光相關(guān)譜（圖4b）中，在（405，425）nm處不存在交叉峰，表明兩峰熒光強(qiáng)度隨外擾變化速率相同，進(jìn)一步確認(rèn)兩峰來源相同，都來自混合溶液的苯并[a]芘。圖4c為異步譜在471 nm處的切譜，可以看到471 nm與417、443 nm之間存在交叉峰，結(jié)合上述分析結(jié)果（471 nm峰來自苯并[ghi]苝，425 nm峰來自苯并[a]芘，417和433 nm處熒光峰來源相同），可推測(cè)417和433 nm熒光峰來自混合溶液中的苯并[k]熒蒽。因433和443 nm處峰與471 nm和491 nm兩處峰來源都不相同，推測(cè)491 nm處峰來自混合溶液中的苯并[a]芘，443 nm處峰來自苯并[k]熒蒽。

圖4a 體系二同步譜

圖4b 體系二異步譜

圖4c 體系二異步471 nm處切譜

圖5a和圖5b為體系三的異步二維相關(guān)熒光譜和在433 nm處的切譜，從圖5a、5b可知，433 nm與405、425、471和500 nm處存在交叉峰；471 nm與405、425、433、443和459 nm處存在交叉峰，進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)：混合溶液中405、425、459和491 nm處熒光峰來自苯并[a]芘，417、433和443 nm處熒光峰來自苯并[k]熒蒽，471、480和500 nm處熒光峰來自苯并[ghi]苝，解析結(jié)果與單組份熒光峰（圖1）位置一致。

圖5a 體系三異步譜

圖5b 體系三異步433 nm處切譜

3 結(jié)論

采用二維熒光相關(guān)譜方法對(duì)苯并[a]芘、苯并[ghi]苝和苯并[k]熒蒽混合溶液中的重疊熒光峰進(jìn)行解析。研究結(jié)果表明：二維熒光相關(guān)譜方法解析出的各物質(zhì)的熒光峰位置與單組份一維熒光譜圖中各物質(zhì)熒光峰的位置相符，并且能夠解析出更多的熒光特征信息。該方法操作簡(jiǎn)單，具有較強(qiáng)的光譜分辨能力，是一種對(duì)混合體系中多環(huán)芳烴重疊熒光峰進(jìn)行解析的有效方法。

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Implementation of fluorescence spectral overlap resolution using two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy

ZHANG Jing, LIU Chun-yu, LIAN Zeng-yan, YANG Yan-rong, SUN Guo-hong, YANG Ren-jieCorresponding Author

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）, which have low residual amounts and various types, are important environmental pollutants. It is difficult to analyze the overlapping fluorescent peaks of PAHs in complex systems by conventional fluorescence spectroscopy. Two-dimensional（2D）fluorescence correlation spectroscopy was used to analyze the fluorescence peaks of a mixture of three PAHs, benzo[a]pyrene, benzo[ghi]pyrene and benzo[k]fluoranthene. A total of 30 mixed solution samples were prepared, and the one-dimensional（1D）fluorescence spectra were collected. On this basis, synchronous and asynchronous 2D correlation spectra were calculated for the 1D dynamic fluorescence spectra under the external disturbance of PAHs concentration. Based on the uncovered fluorescence peak of benzo[ghi]perylene at 500 nm in 1D fluorescence spectra, the sources of overlapping peaks were confirmed in mixed solutions in terms of the positive and negative cross peaks in synchronous spectra and the presence or absence of cross peaks in asynchronous spectra. The fluorescence peaks at 405, 425, 459 and 491 nm were assigned to benzo[a]pyrene; the fluorescent peaks at 471, 480 and 500 nm were assigned to benzo[ghi]perylene; the fluorescent peaks at 417, 433 and 443 nm were assigned to benzo[k]fluoranthene. The results showed that 2D fluorescence correlation spectroscopy can effectively resolve the overlapping fluorescent peaks of PAHs in complex systems and provide more spectral characteristics information.

two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy; benzo[a]pyrene; benzo[ghi]perylene; benzo[k]fluorene; overlapping peak; resolution

1008-5394（2019）04-0095-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.019

O657.33

A

2019-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（41771357, 21607114, 31201359）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（18JCYBJC96400，14JCYBJC30400）

張婧（1995-），女，碩士在讀，主要從事光譜檢測(cè)方面的研究。E-mail：15737313523@163.com。

楊仁杰（1978-），男，教授，博士，主要從事光譜檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用方面的研究。E-mail：rjyang1978@163.com。

責(zé)任編輯：楊霞