當(dāng)歸提取物軟膏劑的工藝處方研究

劉彤，王雪萌，劉黎瑤,,通信作者，王慶奎

（1.天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

與傳統(tǒng)中藥粉末外敷使用相比，將中藥提取物制備成軟膏劑的形式經(jīng)皮給藥之后，能夠增加表皮單位面積處藥物的有效成分含量，利于提高藥效。同時(shí)，通過(guò)選擇適宜的軟膏劑類型，能夠?qū)χ兴幪崛∥镉行С煞值幕钚约右员Ｗo(hù)，防止其在長(zhǎng)期放置過(guò)程中失活或者失效[1]。當(dāng)歸是傘形科當(dāng)歸屬的多年生草本植物，常以其干燥根入藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：當(dāng)歸提取物中富含多種黃酮類等有效物質(zhì)，外用具有清除自由基、抗氧化以及抗炎抗菌等作用，有利于皮膚損傷性疾病的防治與預(yù)防[2]。因此，本研究中，將當(dāng)歸提取物制備成易于外用給藥的油包水（W/O）型軟膏劑，以外觀均一性、涂抹延展性、離心穩(wěn)定性及耐寒耐熱性的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果作為考察指標(biāo)[3]，通過(guò)正交篩選的方法，考察了處方中油相比例、乳化劑以及輔助乳化劑的用量對(duì)軟膏劑成型性的影響，并且確定了制備當(dāng)歸提取物軟膏劑的最優(yōu)工藝處方。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（Sartorius，BSA 223S）、超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)儀器有限公司，KH5200B型）、紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）、低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司，L550）、高速粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋等。

1.2 試劑

中藥當(dāng)歸飲片（天津老百姓大藥房，產(chǎn)地：甘肅岷縣）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定院，HPLC≥98%）、凡士林（天津奧淇洛譜商貿(mào)有限公司，分析純）、Span-60、Tween-80、硬脂酸、羊毛脂、75%乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，分析純），其他試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 當(dāng)歸提取物的提取方法

稱取適量干燥至恒重的當(dāng)歸飲片，使用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩，棄去粗渣，留細(xì)粉待用。按參考文獻(xiàn)[4]報(bào)道，在輔助加熱條件下對(duì)當(dāng)歸細(xì)粉進(jìn)行超聲提取。具體操作方法為：稱取30 g當(dāng)歸細(xì)粉置于250 mL三角瓶中，向其中加入150 mL 75%乙醇，在80 ℃水浴條件下進(jìn)行超聲提取30 min，放冷后使用濾紙過(guò)濾，棄去藥渣。將濾液在4 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液進(jìn)行減壓濃縮，至提取物濃度約為1 g/mL，作為當(dāng)歸提取物浸膏，密封置于4 ℃條件下備用。

2.2 當(dāng)歸提取物中總黃酮含量的測(cè)定[5]

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于容量瓶中，加入75%乙醇超聲溶解并定容至100 mL，配制得到濃度為100 μg/mL的儲(chǔ)備液。使用移液管精密移取適量?jī)?chǔ)備液，使用75%乙醇稀釋得到系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過(guò)紫外-可見分光光度法，在260 nm波長(zhǎng)條件下，測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，擬合得出線性回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 精密度測(cè)定

取2.2.1項(xiàng)下低、中、高濃度的線性樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其在260 nm波長(zhǎng)下的吸光度，記錄吸光度數(shù)值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2.2.3 加樣回收試驗(yàn)

精密量取已知總黃酮含量的當(dāng)歸提取物浸膏，向其中加入適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，并使用75%乙醇稀釋定容，使得其中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為1、5、10 μg/mL。經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，通過(guò)紫外-可見分光光度法，測(cè)定續(xù)濾液在260 nm波長(zhǎng)下的吸光度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的加樣回收率。

2.2.4 提取物中總黃酮含量測(cè)定

精密量取適量當(dāng)歸提取物浸膏至容量瓶中，使用75%乙醇稀釋定容。經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾之后，取續(xù)濾液作為供試品溶液，通過(guò)紫外-可見分光光度法，測(cè)定其在260 nm波長(zhǎng)下的吸光度，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算當(dāng)歸提取物中總黃酮的含量。

2.3 當(dāng)歸提取物軟膏劑的處方研究

2.3.1 處方篩選

根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和前期試驗(yàn)結(jié)果，本研究中，以特定比例的羊毛脂-凡士林-硬脂酸（質(zhì)量比例為1∶3∶4）作為復(fù)合油相[3]，以Span-60作為乳化劑，并且選擇了Tween-80作為輔助乳化劑。前期單因素研究發(fā)現(xiàn)油相比例、乳化劑以及輔助乳化劑的用量這3大因素對(duì)于軟膏劑的成型性影響較大，因此，擬通過(guò)3因素3水平（L9，34）的正交設(shè)計(jì)，對(duì)上述3大因素進(jìn)行用量篩選。因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） %

2.3.2 考察指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法

在處方篩選的過(guò)程中，通過(guò)外觀均一性、涂抹延展性、離心穩(wěn)定性以及耐寒耐熱性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照表2所示的考察指標(biāo)評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。各項(xiàng)考察指標(biāo)的評(píng)價(jià)方法如下所示。

（1） 外觀均一性評(píng)價(jià)：取適量樣品，目檢外觀是否色澤均勻、靜置是否發(fā)生自然分層，記錄目檢結(jié)果并評(píng)分。

（2） 涂抹延展性評(píng)價(jià)：取適量樣品，在濾紙上小心涂抹，觀察其均勻涂布的難易程度，記錄結(jié)果并評(píng)分。

（3） 離心穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：分別取各處方下的軟膏劑樣品1 g，置于離心管中，于4 000 r/min的條件下離心30 min，觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象，記錄結(jié)果并評(píng)分。

（4） 耐寒性評(píng)價(jià)：分別取各處方下的軟膏劑樣品1 g，置于離心管中，于-20 ℃條件下靜置24 h，觀察上述試驗(yàn)樣品是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象，記錄結(jié)果并評(píng)分。

（5） 耐熱性評(píng)價(jià)：另分別取各處方下樣品1 g置于離心管中，于60 ℃恒溫箱中靜置24 h，觀察上述試驗(yàn)樣品是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象，記錄結(jié)果并評(píng)分。

對(duì)上述5項(xiàng)試驗(yàn)的得分進(jìn)行加和，作為最終綜合評(píng)分結(jié)果。

表2 處方篩選各項(xiàng)考察指標(biāo)評(píng)分表

2.4 制備工藝

根據(jù)正交設(shè)計(jì)得到的各個(gè)處方，通過(guò)乳化法來(lái)制備當(dāng)歸提取物軟膏劑，在制備過(guò)程中，各個(gè)處方的制備總量相同，并且其中當(dāng)歸提取物浸膏的加入量也保持一致，以便能夠更好地進(jìn)行平行比較。首先取處方量的油相，置于80 ℃水浴條件下，使油相受熱呈液體狀態(tài)后，向其中加入處方量的Span-60，繼續(xù)置于80 ℃水浴條件下，保溫待用。另取適量浸膏液，置于適量蒸餾水中，作為水相，并且向其中加入處方量的Tween-80，攪拌至分散均勻。在80 ℃水浴保溫的條件下，將油相滴加至水相中，全程保持勻速攪拌。至滴加結(jié)束后，于室溫條件下繼續(xù)保持勻速攪拌15 min，放涼即得。

2.5 優(yōu)化處方下當(dāng)歸提取物軟膏劑的穩(wěn)定性考察

在優(yōu)選的處方設(shè)計(jì)下，制備3批當(dāng)歸提取物軟膏劑，分別對(duì)其外觀均一性、涂抹延展性、離心穩(wěn)定性以及耐寒耐熱性進(jìn)行評(píng)價(jià)。并且，于4℃條件下密封放置0、1、2個(gè)月，對(duì)該優(yōu)選處方下放置穩(wěn)定性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 當(dāng)歸提取物中總黃酮含量的測(cè)定

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照既定的試驗(yàn)方法，配制了不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，依法使用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：以吸光度Abs（縱坐標(biāo)，y）對(duì)濃度c（μg/mL，橫坐標(biāo)，x）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y＝0.076 8x＋0.013（R2＝0.999 1）。線性測(cè)定結(jié)果（如圖1所示）表明：在既定測(cè)定方法下，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液在1.0～10.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2 精密度測(cè)定

按照既定的試驗(yàn)方法，低、中、高濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的精密度測(cè)定結(jié)果如表3所示。對(duì)低、中、高濃度對(duì)照品溶液分別連續(xù)重復(fù)5次測(cè)定的RSD值均小于2%，表明本法的精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.1.3 加樣回收率試驗(yàn)

依法進(jìn)行蘆丁對(duì)照品的回收率測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表4所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明：在既定的測(cè)定方法下，低、中、高濃度樣品的回收率均大于95%，并且平均回收率的RSD值均小于2%，表明既定測(cè)定方法的回收率合格。

表4 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

3.1.4 提取物中總黃酮含量測(cè)定

依法對(duì)當(dāng)歸提取物中的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明：在輔助加熱的條件下，對(duì)當(dāng)歸細(xì)粉進(jìn)行超聲提取，提取物中總黃酮的含量為21.83 mg/mL。

3.2 當(dāng)歸提取物軟膏劑的處方研究

通過(guò)3因素3水平（L9，34）正交設(shè)計(jì)，以外觀均一性、涂抹延展性、離心穩(wěn)定性以及耐寒耐熱性評(píng)價(jià)的綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)油相/水相比例、乳化劑以及輔助乳化劑的用量進(jìn)行了正交篩選，得出制備當(dāng)歸提取物軟膏劑的最佳處方，正交分析結(jié)果如表5所示。

表5 軟膏劑處方篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果

分析結(jié)果表明：在影響該軟膏劑成型性的3大因素中，油相比例對(duì)成型性的影響較大，其次是乳化劑Span-60，再次是Tween-80。但是，在正交分析結(jié)果中，上述3者的極差值差異較小，尤其是因素A（油相比例）和因素B（乳化劑Span-60的用量）的極差值基本相同，表明上述3者對(duì)于成型影響的權(quán)重程度相差不大。通過(guò)正交極差分析得出最優(yōu)的處方為A2B2C3，即油相的比例為35.0%（w/w）、乳化劑Span-60的用量為4.0%（w/w）、輔助乳化劑Tween-80的加入量為4.5%（w/w）。

3.3 優(yōu)化處方下軟膏劑的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

按照最優(yōu)處方條件制備了3批當(dāng)歸提取物軟膏劑，并且對(duì)其放置穩(wěn)定性進(jìn)行了初步的評(píng)價(jià)，結(jié)果如表6所示。結(jié)果表明：優(yōu)選處方下，所制備的3批當(dāng)歸提取物軟膏劑中總黃酮的含量為0.22%±0.13%（w/w），目檢外觀完全均勻，涂抹細(xì)膩無(wú)顆粒，耐寒耐熱性評(píng)價(jià)結(jié)果良好，離心穩(wěn)定性良好，于4 000 r/min的條件下離心30 min，未發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象。

表6 當(dāng)歸提取物軟膏劑的放置穩(wěn)定性評(píng)價(jià)（4 ℃）

將上述3批當(dāng)歸提取物軟膏劑置于4 ℃條件下，進(jìn)行放置穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：優(yōu)選處方下當(dāng)歸提取物軟膏劑放置2個(gè)月以內(nèi)穩(wěn)定性良好，總黃酮含量、外觀、涂抹延展性、耐寒耐熱性以及離心穩(wěn)定性均未發(fā)生顯著變化。

4 討論

4.1 當(dāng)歸提取物軟膏劑類型的選擇

按照乳化類型的不同，軟膏劑可分為水包油（O/W）型與油包水（W/O）型軟膏劑，在本項(xiàng)研究中，選擇將當(dāng)歸提取物制備成油包水（W/O）型軟膏劑。其主要原因包括下述兩方面。

（1）保護(hù)提取物中黃酮成分的穩(wěn)定性[6-7]。研究表明：黃酮類有效成分具有酚羥基結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗氧化等作用。在油包水（W/O）型軟膏劑中，通過(guò)乳化劑以及輔助乳化劑的作用，形成油相包覆水相的乳化結(jié)構(gòu)，外層油相能夠?qū)?nèi)層水相與外界隔離開，從而避免內(nèi)層有效成分在貯存過(guò)程中發(fā)生氧化等反應(yīng)。在本研究中，將當(dāng)歸提取物浸膏制備成油包水（W/O）型軟膏劑，能夠有效保護(hù)內(nèi)層水相中的總黃酮，避免其被空氣中的氧氣等因素所氧化失效，從而更好地發(fā)揮其抗氧化作用。

（2）油脂保護(hù)作用[8]。在實(shí)際應(yīng)用中，外用油包水（W/O）型軟膏劑后，能夠在皮膚表層覆蓋1層油脂膜，增強(qiáng)皮膚的水合作用，易于有效成分經(jīng)皮遞送。因此，將當(dāng)歸提取物浸膏制備成油包水（W/O）型軟膏劑，有利于其中總黃酮類成分的經(jīng)皮遞送發(fā)揮目標(biāo)作用[9]。

4.2 處方中Tween-80的作用

本研究中，加入了Tween-80用以調(diào)節(jié)主乳化劑Span-60的親水親油平衡值（HLB值）。主乳化劑Span-60是常用的油包水（W/O）型乳化劑，生物相容性良好。但是，在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：由于Span-60的HLB值較高，單獨(dú)使用Span-60制備得到的油包水（W/O）型軟膏劑容易發(fā)生油水分離的現(xiàn)象，因此，加入了Tween-80以將其HLB值調(diào)節(jié)至適宜水平[10-12]，并且在處方篩選中，通過(guò)正交設(shè)計(jì)對(duì)Tween-80的加入量進(jìn)行了篩選，從而得到性質(zhì)穩(wěn)定的軟膏劑。

4.3 處方中復(fù)合油相的選用

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)以及文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)使用目前常用的油脂性基質(zhì)來(lái)制備軟膏劑時(shí)，所形成的軟膏劑穩(wěn)定性差且過(guò)于油膩，流變性質(zhì)不符合軟膏劑的特征，因此，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，在本研究的處方篩選中，選擇使用羊毛脂-凡士林-硬脂酸（質(zhì)量比例為1∶3∶4）作為復(fù)合油相。該復(fù)合比例的油相黏度與硬度適中，利于后期軟膏劑的成型與涂布。

在傳統(tǒng)中藥的研究中，通常是將中藥研磨成細(xì)粉后，再混合于軟膏劑基質(zhì)中進(jìn)行外用給藥[13-15]。而本研究通過(guò)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行了處方研究，將當(dāng)歸提取物制備得到軟膏劑，相對(duì)于中藥粉末直接給藥，此方法大大增加了單位給藥面積處的有效成分含量，并且更有利于有效成分經(jīng)皮遞送，具有很大的發(fā)展空間及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在后期的研究中，會(huì)對(duì)制劑處方進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，考慮在油相中加入維生素E等抗氧化成分，以達(dá)到充分保護(hù)當(dāng)歸提取物總黃酮成分活性的目的。