多環(huán)芳烴（菲）添加對珠江河口農(nóng)村和城市河流濕地土壤氮礦化過程的影響

尹 碩，白軍紅，溫曉君，張光亮，韓 玲，胡星云

（水環(huán)境模擬國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100875）

土壤氮素是植物生長發(fā)育的重要生源要素，對植物群落多樣性和生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)力的維持和提升具有重要作用[1]。在天然濕地生態(tài)系統(tǒng)中，氮素是最重要的養(yǎng)分之一，其傳輸過程顯著影響濕地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[2-3]。其中，氮礦化過程是生物地球化學(xué)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，它不僅可以將植物難以利用的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為易吸收的無機(jī)氮并調(diào)節(jié)植物生長，而且土壤氮的硝化作用可以進(jìn)一步產(chǎn)生溫室氣體N2O，進(jìn)而影響全球氣候[4]。

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類含有至少兩個(gè)苯環(huán)且廣泛分布在自然界各類生態(tài)系統(tǒng)中的有機(jī)污染物[5]，具有“三致”效應(yīng)和生物累積效應(yīng)[6]。多環(huán)芳烴可以通過影響微生物或土壤酶活性從而影響氮素循環(huán)過程。劉杰[7]通過室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)中濃度（40～80μg·g-1）多環(huán)芳烴芘對土壤微生物群落產(chǎn)生較小影響，而中濃度芘對氨氧化微生物活性則產(chǎn)生顯著抑制作用。脲酶是參與有機(jī)氮礦化過程的重要水解酶，有研究表明受多環(huán)芳烴污染的土壤中脲酶活性會受到不利影響，其中萘對土壤脲酶活性的抑制作用最大，而芘的抑制作用最小[8]。

珠江三角洲濕地是我國重要的河口濕地，但近幾年由于珠三角城市群發(fā)展迅猛，而暴露出許多環(huán)境問題。位于珠江河口的廣州市番禺區(qū)由于工業(yè)發(fā)展迅速，給流經(jīng)該區(qū)的城市河流（接收超億噸廢水）和農(nóng)村河流（主要飲用水源）帶來了嚴(yán)重的污染。城市河流濕地受到工業(yè)廢水、電鍍和皮革生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的污染，而農(nóng)村河流受到來自食品、油脂和肉類工廠等農(nóng)業(yè)廢水的污染，兩者分別受到不同程度的多環(huán)芳烴污染[9]。Xiao等[10]研究表明珠江河口濕地土壤中PAHs污染高于亞洲其他一些河口濕地。近年來許多學(xué)者都集中在土壤理化性質(zhì)、溫度、濕度、凋落物及氮磷添加對氮礦化的影響[11-13]，而對土壤中多環(huán)芳烴的研究則集中在來源分布、降解及修復(fù)[10，14-15]方面，面對多環(huán)芳烴污染的加劇，氮礦化對多環(huán)芳烴的響應(yīng)機(jī)制研究尚不多見。因此，本文采用室內(nèi)培養(yǎng)法探究不同濃度菲添加對珠江河口工業(yè)區(qū)農(nóng)村和城市河流濕地氮礦化的影響機(jī)理，可為珠江三角洲受污染脅迫的河流濕地土壤的治理和修復(fù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

珠江三角洲位于我國廣東省中南部，珠江下游，瀕臨南海。大部分屬于熱帶地區(qū)，亞熱帶海洋季風(fēng)氣候。降水量在年內(nèi)較集中，4—9月的降雨量約占全年83%，年降水量約2100 mm，平均蒸發(fā)量為1350 mm。該地區(qū)全年日照時(shí)數(shù)為1900～2200 h，多年平均氣溫在22℃左右。該區(qū)土壤主要有赤紅壤、潴育型水稻土、鹽漬型水稻土和濱海鹽漬土等。研究區(qū)內(nèi)植被以莎草科植物為主。研究區(qū)位置如圖1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及測定

圖1 研究區(qū)位置圖Figure 1 Location map of the study area

本研究在廣東省廣州市番禺區(qū)選擇典型農(nóng)村河流濕地和城市河流濕地進(jìn)行樣品采集。實(shí)驗(yàn)土壤樣品采集時(shí)間為2015年5月。采樣時(shí)將地表植被凋落物等雜物去除，用塑料鏟采集土壤表層（0～10 cm）土壤，分別在兩類濕地內(nèi)隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣地，每個(gè)樣地隨機(jī)采集3個(gè)樣品進(jìn)行混合，混合均勻后裝入塑封袋編號，帶回實(shí)驗(yàn)室待用。供試土壤性質(zhì)如表1所示。

本研究選取農(nóng)村和城市河流濕地鮮土進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)珠江三角洲濕地土壤有機(jī)污染狀況及早期研究結(jié)果[10]，本實(shí)驗(yàn)多環(huán)芳烴添加物選擇菲，濃度分別設(shè)置為無（0，A）、低（15 mg·kg-1，B）、高（100 mg·kg-1，C）3個(gè)水平。城市河流濕地和農(nóng)村河流濕地土壤菲的初始平均含量分別為144.4 ng·g-1和127.2 ng·g-1。

首先將土壤在25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，活化3 d后進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)。將不同濃度的菲溶液分別加入相當(dāng)于100 g干土的鮮土樣品中，然后將處理后的樣品放入培養(yǎng)容器中，并用塑料膜封口，統(tǒng)一放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期向樣品中補(bǔ)充水分。多環(huán)芳烴對微生物具有慢性毒性，因此將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為0、7、14、21、28、35 d和42 d。在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取出3個(gè)樣品并測定土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度、脲酶活性、氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）等能夠反應(yīng)有機(jī)氮礦化過程的指標(biāo)。

土壤pH值用pH計(jì)（Sartorius PB-10）測定；土壤含水量采用烘干法測定；土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定；土壤總氮和總氫采用元素分析儀（CHNOS Elemental Analyzer，Vario EL，German）測定；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮使用流動分析儀（Bran+Luebbe，Germany）測定。脲酶活性用比色法測定[16]。采用熒光定量PCR測定氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的amoA基因拷貝數(shù)量。

1.3 計(jì)算方法

表1 農(nóng)村和城市河流濕地土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemical properties of rural and urban river wetlands

式中：i為取樣批次；t為取樣時(shí)間，d；M、N、A分別代表凈氮礦化量、硝化量和氨化量，mg·kg-1；RM、RN、RA分別代表凈氮礦化速率、硝化速率和氨化速率，mg·kg-1·d-1。

平均礦化、氨化、硝化速率指的是單位時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（t=42）與培養(yǎng)初始時(shí)（t=0）氮礦化量、氨化量、硝化量的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的初步處理通過Excel 2010實(shí)現(xiàn)，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，判定多環(huán)芳烴添加對土壤氮素平均礦化速率、氨化速率、硝化速率的顯著性差異以及對脲酶活性的影響。圖形繪制通過OriginPro 2017完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)氮礦化過程

由圖2和圖3可知，農(nóng)村河流濕地和城市河流濕地土壤硝化速率和礦化速率大約在21 d達(dá)到較高值，而氨化速率約在21 d或35 d出現(xiàn)峰值；硝化速率和礦化速率在35 d出現(xiàn)最低值，而氨化速率較低值則約在14 d和28 d出現(xiàn)，這可能是參與氨化和硝化過程的微生物的適應(yīng)性和底物不同導(dǎo)致的[17]。兩種濕地土壤氨化速率變化范圍為-3.823～4.677 mg·kg-1·d-1，硝化速率的變化范圍為-4.990～5.369 mg·kg-1·d-1，而礦化速率在-4.885～5.877 mg·kg-1·d-1范圍內(nèi)波動。在培養(yǎng)期內(nèi)，農(nóng)村河流濕地和城市河流濕地土壤中固氮和礦化過程同時(shí)發(fā)生并呈波動性變化。由于硝化速率變動范圍較大，所以礦化速率變化趨勢主要受硝化速率的影響（圖2和圖3）。在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)，農(nóng)村河流濕地土壤氮礦化平均速率為正值，表現(xiàn)為凈氮礦化；而城市河流濕地土壤氮礦化平均速率為負(fù)值，表現(xiàn)為凈氮固定（表2）。這可能與兩種濕地土壤含水量不同有關(guān)。城市河流濕地土壤因含水量大導(dǎo)致透氣性變差（表1），使反硝化菌活性變強(qiáng)，反硝化作用明顯，導(dǎo)致氮礦化速率為負(fù)值[18]。同時(shí)，土壤中氮礦化速率與土壤中碳氮比有很大關(guān)系。碳氮比可反應(yīng)基質(zhì)中氮含量水平，在底物濃度較高情況下，土壤微生物對氮的固定作用可能更強(qiáng)，使礦化速率顯示出隨碳氮比增加而減小的變化趨勢[19]，所以城市河流濕地土壤氮的平均礦化速率小于農(nóng)村河流濕地土壤。

圖2 不同菲添加處理下農(nóng)村河流濕地土壤氨化、硝化、礦化速率動態(tài)變化Figure 2 Dynamic changes in the rates of ammoniation，nitrification and mineralization in rural river wetland soils under different phenanthrene addition treatments

圖3 不同菲添加處理下城市河流濕地土壤氨化、硝化、礦化速率動態(tài)變化Figure 3 Dynamic changes in the rates of ammoniation，nitrification and mineralization in urban river wetland soils under different phenanthrene addition treatments

不同劑量多環(huán)芳烴菲添加對兩種濕地土壤的礦化速率影響不同。由表2可知，除低濃度和高濃度處理的平均氨化速率無顯著性差異外（P＞0.05），農(nóng)村河流濕地土壤氮的轉(zhuǎn)化速率隨多環(huán)芳烴濃度升高而降低。所以，農(nóng)村河流濕地土壤的多環(huán)芳烴菲添加不利于土壤氮礦化，表明在培養(yǎng)過程中多環(huán)芳烴菲對氮礦化相關(guān)微生物產(chǎn)生毒性作用較強(qiáng)，致使活性變低，不利于礦化過程的進(jìn)行[20]。但在城市河流濕地中，高濃度菲添加處理組的3種氮轉(zhuǎn)化速率最高，其次是無添加處理組，而低濃度菲添加處理組的氮轉(zhuǎn)化速率最低。由于城市河流濕地的各處理顯示礦化速率為負(fù)值，所以培養(yǎng)期內(nèi)氮礦化作用較弱，這表明該區(qū)域濕地土壤中反硝化菌對氮礦化過程可能起主要作用[18]。已有研究表明[21-22]，多環(huán)芳烴可以降低反硝化菌活性以及反硝化菌群的豐度和多樣性，所以在高濃度處理?xiàng)l件下反硝化過程受到強(qiáng)烈抑制，加之高濃度多環(huán)芳烴可以提供更多底物，使礦化量增加。雖然低濃度多環(huán)芳烴菲添加也會抑制反硝化過程，但是由于其毒性效應(yīng)較低，提供的基質(zhì)較少，所以比高濃度處理下平均礦化速率低。但低濃度處理比無添加處理的平均礦化速率更低，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

在農(nóng)村河流濕地中，多環(huán)芳烴菲對氮礦化的抑制作用影響植物對氮的攝入及其生長發(fā)育，增加了該區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的退化風(fēng)險(xiǎn)。而對于城市河流濕地，高濃度菲添加在一定時(shí)間內(nèi)可能提高植物對氮的利用量。因此，多環(huán)芳烴菲的添加會改變氮轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而影響濕地初級生產(chǎn)力，改變濕地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[2-3]。

2.2 土壤脲酶活性

兩種濕地土壤脲酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長均呈現(xiàn)出下降的趨勢（圖4）。在農(nóng)村河流濕地中，從14 d開始多環(huán)芳烴菲添加處理對脲酶活性表現(xiàn)出明顯作用，培養(yǎng)21 d時(shí)，低濃度處理對脲酶活性表現(xiàn)出明顯的抑制作用（P＜0.01），而高濃度處理則表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01）。21 d時(shí)，高濃度菲處理下土壤脲酶活性達(dá)到最高值（約400 mg NH+4-N·kg-1·2h-1），同時(shí)氨化速率也達(dá)到峰值（圖2），顯著促進(jìn)了土壤氮的氨化過程。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，低濃度菲添加處理表現(xiàn)出促進(jìn)作用，而高濃度菲添加處理的促進(jìn)作用在后期逐漸消失，與無添加處理組的土壤脲酶活性無顯著差異（P＞0.05）。在城市河流濕地中，高濃度菲添加處理在培養(yǎng)前期對土壤脲酶活性呈現(xiàn)出毒性作用，但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長脲酶活性呈現(xiàn)波動式上升，最終與無添加處理的土壤脲酶活性相近。低濃度菲添加處理下土壤脲酶活性在0～7 d時(shí)突然升高，隨后呈波動式下降，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)則顯著低于其他兩種處理（P＜0.01）。

土壤脲酶活性的波動變化主要有以下兩個(gè)原因[23]：第一，土壤中添加菲等有效底物促進(jìn)土壤微生物生長和酶誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致土壤脲酶活性升高；第二，菲的脅迫作用導(dǎo)致土壤脲酶活性的下降，這主要是可用底物的減少和菲的生物利用度降低引起的。Zhan等[23]將多環(huán)芳烴污染對土壤中酶活性的影響劃分為兩個(gè)階段，第一階段為8～16 d，第二階段為16 d后。本研究結(jié)果都是從14 d左右開始，多環(huán)芳烴菲對脲酶活性顯示出明顯或波動性促進(jìn)的作用。在農(nóng)村河流濕地中，培養(yǎng)21 d時(shí)，高含量菲對脲酶活性的刺激作用顯現(xiàn)并隨時(shí)間增加而降低。葛高飛等[24]研究也表明，在高濃度菲處理?xiàng)l件下會產(chǎn)生刺激作用，從而使脲酶活性升高，但隨時(shí)間增加這種刺激作用會減弱，這與本研究結(jié)果一致。但在城市河流濕地中高濃度菲處理中未發(fā)現(xiàn)明顯刺激作用，這可能是兩種濕地土壤微生物的敏感性不同所致[15]。在42 d培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，除高濃度菲添加處理的農(nóng)村河流濕地土壤外，多環(huán)芳烴菲的添加總體上利于土壤脲酶活性的維持（表3），可見多環(huán)芳烴的刺激作用在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)都存在。而宮璇等[25]則認(rèn)為2.4 mg·kg-1以內(nèi)的菲添加處理在7 d內(nèi)對土壤脲酶活性呈顯著抑制作用，7 d后則與空白處理相同，這可能與多環(huán)芳烴添加的濃度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)[26]。在不同菲添加處理下城市河流濕地土壤脲酶活性變化率高于農(nóng)村河流濕地土壤（P＜0.01），且多環(huán)芳烴菲的添加更利于城市河流濕地土壤脲酶活性的維持，這可能與有機(jī)質(zhì)含量有關(guān)。有機(jī)質(zhì)可能通過兩種方式影響土壤脲酶活性，從而導(dǎo)致土壤脲酶活性變化率不同。首先，有機(jī)質(zhì)通過影響微生物活性以及膠體粒子的吸附影響脲酶活性，在高含量有機(jī)質(zhì)土壤中脲酶活性處于較高水平[27-28]。所以無添加處理中城市河流濕地土壤脲酶活性變化率低于農(nóng)村河流濕地土壤。其次，高有機(jī)質(zhì)含量對PAHs的吸附限制了其降解，降低了其生物毒性，從而使脲酶活性處于較高水平[29]。

表3 不同菲添加處理下培養(yǎng)前后農(nóng)村河流和城市河流濕地土壤脲酶活性及變化率Table 3 Changes in urease activities and their changing rates in rural and urban river wetland soils before and after incubation under different phenanthrene addition treatments

2.3 AOA和AOB功能基因變化

圖5表明，在農(nóng)村河流濕地中，除低濃度菲添加處理下AOA比例呈降低趨勢外，其他兩種處理在培養(yǎng)后AOA的占比增多，可初步判斷AOB在低濃度菲污染條件下適應(yīng)性更強(qiáng)。在無添加和高濃度菲添加處理下AOA比例隨培養(yǎng)時(shí)間增加而變大，但高濃度菲添加處理下AOA比例的增幅小于無添加組，所以AOB對多環(huán)芳烴的適應(yīng)性更強(qiáng)，且對低濃度菲的適應(yīng)性最高。與農(nóng)村河流濕地相反，AOA與AOB的比例在城市河流濕地中基本沒有太大變化，說明多環(huán)芳烴可能對該濕地氨氧化反應(yīng)微生物群落結(jié)構(gòu)無明顯作用，這可能與兩種濕地受多環(huán)芳烴污染的程度不同有關(guān)[9]。

圖5 不同菲添加處理下農(nóng)村河流濕地和城市河流濕地AOA和AOB比例的變化Figure 5 Changes of AOA and AOB ratios in rural and urban river wetland soils before and after incubation under different phenanthrene addition treatments

總體上，農(nóng)村河流濕地土壤中氨氧化反應(yīng)的主導(dǎo)微生物為AOB，而城市河流濕地土壤中氨氧化反應(yīng)的主導(dǎo)微生物為AOA。這可能與兩類濕地土壤pH和土壤有機(jī)質(zhì)的差異有關(guān)（表1），許多研究也表明氨氧化微生物豐度與pH有關(guān)。Nicol等[30]認(rèn)為隨土壤pH升高，AOA豐度降低，所以在pH較低的城市河流濕地，AOA的比重較大。但Li等[31]認(rèn)為AOB/AOA比值與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，這可能是由于土壤類型和氨氧化菌對不同pH的耐受程度不同導(dǎo)致的[32]。同時(shí)，Sims等[33]報(bào)道了密蘇里州濕地土壤有機(jī)碳利于AOA存活，這可能是因?yàn)锳OA積極參與土壤中碳同化過程[34]，從而利于其在有機(jī)質(zhì)豐富的城市河流濕地土壤中存活。此外，蘇瑜等[35]發(fā)現(xiàn)土壤總氮的含量與AOA豐度呈顯著正相關(guān)，與AOB豐度呈負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)論一致。

3 結(jié)論

（1）不同菲添加處理下兩類濕地土壤氮礦化速率范圍為-4.885～5.877 mg·kg-1·d-1。總體上，多環(huán)芳烴菲添加不利于農(nóng)村河流濕地土壤氮礦化。高濃度菲添加利于城市河流濕地土壤氮礦化，而低濃度菲添加則利于土壤氮固定。

（2）42 d培養(yǎng)后，不同菲添加處理下土壤脲酶活性均呈下降趨勢，但高、低濃度菲添加處理利于土壤脲酶活性的維持，變化幅度均小于無添加處理（高濃度處理的農(nóng)村河流濕地土壤除外），尤其是城市河流濕地，變幅在27%左右。

（3）多環(huán)芳烴菲添加利于農(nóng)村河流濕地土壤AOB存活，低濃度菲添加使AOB的競爭力增強(qiáng)；但多環(huán)芳烴對城市河流濕地土壤氨氧化菌的組成比例基本無影響。

（4）隨著多環(huán)芳烴污染的加劇，農(nóng)村河流濕地和城市河流濕地土壤脲酶活性和氨氧化微生物組成（城市河流濕地除外）會受到顯著影響，從而改變土壤氮的礦化過程，進(jìn)而影響濕地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。