RP-HPLC測定含銀杏葉提取物的注射液中維生素C的含量△

李玉彩，李響明*，周永妍，孫勝斌，姜國志

1.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北 石家莊 051430

銀杏葉提取物具有擴張血管、改善微循環(huán)的作用。含銀杏葉提取物的注射劑主要用于治療缺血性心腦血管疾病、冠心病、心絞痛、腦栓塞、腦血管痙攣等[1-2]。中藥注射劑中往往為了保護主藥，而加入維生素C、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉等抗氧劑。隨著抗氧劑在產(chǎn)品效期內(nèi)的不斷消耗，可能影響到注射劑的安全性、穩(wěn)定性。因此維生素C用量的確定及在產(chǎn)品有效期內(nèi)的變化需建立有效的監(jiān)測控制手段，而這方面的研究相對較少。

維生素C在水溶液中以互變異構(gòu)的形式存在，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被光、溫度、氧氣、金屬離子、pH等影響。由于中藥注射劑在生產(chǎn)過程中加入惰性氣體進行保護，維生素C的降解相對較慢，但在實際測定過程中由于一般不添加惰性氣體或抗氧劑，導(dǎo)致維生素C降解較快，這也為維生素C的準確測定增加了難度。《中華人民共和國藥典》2015年版采用碘量法[3]測定維生素C的含量，文獻已報道過的測定維生素C含量的方法還有滴定分析法[4-6]、苯肼比色法[7]、熒光分析法[8-10]、分光光度法[11]、原子吸收法[12]、高效液相色譜法等[13-15]。因中藥注射劑本身顏色的影響，對滴定法終點的判斷有干擾；再者中藥注射劑中除已知成分和輔料外，還有其他成分，增加了準確測定的難度。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，四元梯度泵；CPA225D電子天平(德國賽多利斯)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KH3200E型超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

乙腈(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸、冰醋酸、磷酸二氫鉀(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純化水；其他試劑均為分析純。

含銀杏葉提取物的注射液為市售產(chǎn)品，如舒血寧注射液、銀杏葉提取物注射液。維生素C對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100425-201504)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4～5)(10∶90)為流動相；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；理論板數(shù)按維生素C峰計算應(yīng)不低于8000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取維生素C對照品適量，置棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液溶解定容，制成每1 mL含維生素C 0.15 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密量取市售含銀杏葉提取物的注射液1 mL置10 mL棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1檢測波長的確定 韓佩蓮等[16]選擇維生素C最大吸收波長為244 nm，也有研究[17-18]維生素C最大吸收波長選擇分別為277 nm和280 nm。本研究中取維生素C對照品適量，制成每1 mL中含維生素C約0.15 mg的溶液，用紫外-可見分光光度計在200～400 nm進行全波長的掃描，結(jié)果在波長280 nm處有最大吸收波長，確定其檢測波長為280 nm。

圖1 維生素C的紫外全波長掃描圖

2.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗 對照品溶液、供試品溶液的高效液相色譜中維生素C理論塔板數(shù)分別是15 625、11 243，供試品溶液中維生素C峰分離較好，峰形對稱，并且陰性無干擾，該方法專屬性良好，見圖2～3。

圖2 對照品溶液的高效液相色譜圖

圖3 供試品溶液的高效液相色譜圖

2.2.3 線性范圍考察 取對照品溶液，分別進樣1、2、5、10、20、30 μL測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線。維生素C進樣量在0.149 1～4.472 6 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3 055.5X+63.415，r=0.999 8。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，測得峰面積RSD為0.7%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液在室溫下避光放置，間隔15 min進樣一次，分別于0、15、30、45、60、75 min測定，結(jié)果維生素C峰面積RSD為0.6%，表明75 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6重復(fù)性試驗 取同一批樣品分別平行制備6份供試品溶液，按照擬定的方法測定維生素C含量，測得維生素C含量的RSD為1.02%，表明重復(fù)性良好。

2.2.7 回收率試驗 取已知含量的樣品9份，分別精密加入一定量的維生素C對照品，分別制成低、中、高3個質(zhì)量濃度的供試品溶液，在上述色譜條件下測定。維生素C的平均回收率為99.65%，RSD為1.12%。

表1 維生素C回收率測定結(jié)果(n=9)

2.3 含量測定

取注射液按照前述方法制備供試品溶液，并按擬定方法測定。供試品溶液維生素C峰形對稱，部分批次結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

銀杏葉提取物注射液中未檢出維生素C，推測處方中未添加維生素C；該廠家說明書成分中無維生素C，與本次測定結(jié)果一致。舒血寧注射液中B廠家未檢出維生素C，A、C廠家維生素C平均質(zhì)量濃度0.70 mg·mL-1，說明本檢測方法可用于市售銀杏葉提取物注射液和舒血寧注射液中維生素C含量的測定。

3 結(jié)論

本研究采用普通液相色譜儀、恒定流速洗脫、固定檢測波長，建立了測定含銀杏葉提取物的注射液中維生素C含量的RP-HPLC方法，結(jié)果表明，該方法簡單可靠，可作為含銀杏葉提取物的注射液中維生素C含量的質(zhì)量控制方法，樣品處理簡便，色譜中各成分峰能達到良好的分離效果，測定結(jié)果準確，快捷，易于掌握，重復(fù)性良好。