平臥菊三七提取物抗氧化活性研究與抗氧化特征成分的HPLC-MS/MS分析△

趙玉榮，陸姍姍，朱張新，張培瑞，劉晨，劉俊，何立巍

南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300

平臥菊三七GynuraprocumbensLour.為菊三七屬多年生草本植物，藥食兼用，多分布于東南亞地區(qū)，如馬來(lái)西亞、泰國(guó)；在我國(guó)主要分布于廣東、云南等地。平臥菊三七具有降糖、抗腫瘤、抗氧化等功效[1-3]。研究表明，平臥菊三七中含有多種顯著抗氧化作用的天然成分，如有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)以及三萜類(lèi)成分[4-5]。但目前研究還未明確平臥菊三七中的具體抗氧化成分。由于平臥菊三七中含有的成分復(fù)雜，DPPH活性檢測(cè)及HPLC-MS/MS技術(shù)正越來(lái)越多被應(yīng)用于其活性成分的發(fā)現(xiàn)與確證[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇回流法提取平臥菊三七中活性成分，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取其中的活性成分得到各部位成分，并結(jié)合體外DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)篩選各部位的抗氧化活性大小。采用HPLC-MS/MS對(duì)抗氧化活性較高的部位進(jìn)行成分的分析，以便進(jìn)一步研究平臥菊三七的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1200系列高效液相色譜儀、6520系列電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS/MS)；真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，恒DZF系列)；分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52A)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，KH-500B型)。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y24J7K16726)；阿魏酸對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：H27J7L16718)；蘆丁對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y01D8S49613)；楊梅素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YM0311YA13)；槲皮素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20J6Y1722)；咖啡酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)；DPPH(Sigma公司)；甲醇為色譜純；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 平臥菊三七提取物的制備

平臥菊三七藥材購(gòu)于江蘇省野生蔬菜研究所，由南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院中藥鑒定教研室劉晨老師鑒定。取干燥地上部分藥材粉碎，稱(chēng)取25 g，每次加入10倍量80%乙醇，80 ℃下回流提取1 h，共提取3次，合并提取液并濃縮至終體積為30 mL，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3次，合并萃取液，濃縮，得各部位樣品。

2.2 平臥菊三七各部位清除DPPH自由基能力的測(cè)定

對(duì)何英杰等[6]的方法進(jìn)行改良，分別將50 μL質(zhì)量濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1的平臥菊三七各部位提取物溶液加入96孔板中，然后再加入150 μL質(zhì)量濃度為0.11 mg·mL-1的DPPH溶液，充分震蕩混合均勻，在室溫避光下靜置10 min。之后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定每孔的吸光度值，記為樣品吸光值A(chǔ)1。陰性對(duì)照組中加入50 μL乙醇，測(cè)定值為A0，陽(yáng)性對(duì)照藥是維生素C(Vc)，每個(gè)試樣做4次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值。自由基的清除率以如下公式計(jì)算。

DPPH自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%

(1)

2.3 液相色譜條件

精密稱(chēng)取平臥菊三七乙酸乙酯部位提取物100 mg，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，配制成質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，由自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 μL；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；采用漢邦Kromasil-C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)，洗脫條件：采用梯度洗脫，0～5 min，10%B；5～25 min，30%B；25～70 min，55%B?；衔镉枚O管陣列檢測(cè)器在254 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)。

2.4 串聯(lián)質(zhì)譜條件

ESI離子源，離子源噴霧電壓： 3.0 kV，霧化器壓力： 0.2 MPa，干燥氮?dú)?N2)流速：9 L·min-1，干燥氮?dú)?N2)溫度：350 ℃，掃描范圍為m/z：100～1000，負(fù)離子模式掃描。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 7軟件計(jì)算藥物對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值。

3 結(jié)果

3.1 平臥菊三七提取物不同極性部位得率及清除DPPH自由基能力的測(cè)定

采用2.1的提取方案，得到石油醚部位0.531 8 g，得率2.1%；乙酸乙酯部位0.084 7 g，得率0.33%；正丁醇部位0.376 5 g，得率1.49%；水部位2.533 0 g，得率10%。按照2.2的方法分別測(cè)定平臥菊三七石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物、乙醇提取物在質(zhì)量濃度0.156～5 mg·mL-1和Vc對(duì)DPPH自由基的清除活性，結(jié)果表明，在最低質(zhì)量濃度0.156 25 mg·mL-1下，乙酸乙酯和正丁醇對(duì)DPPH的抑制率達(dá)到89.17%和62.86%，顯示出較強(qiáng)的清除DPPH自由基活性，不同極性部位清除DPPH自由基的順序?yàn)椋阂宜嵋阴ゲ课?正丁醇部位>乙醇提取物>石油醚部位>水部位。筆者分別測(cè)定了乙酸乙酯部位和正丁醇部位在質(zhì)量濃度為3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500 μg·mL-1和Vc對(duì)DPPH自由基的清除活性，結(jié)果見(jiàn)圖1。Vc、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的IC50分別是12.19、28.8、321 μg·mL-1，表明乙酸乙酯部位對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，提示乙酸乙酯部位中含有的化學(xué)成分可能是平臥菊三七抗氧化的活性成分。因此，我們采用HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析。

圖1 平臥菊三七地上部分提取物乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)DPPH自由基的清除率

3.2 平臥菊三七乙酸乙酯部位化學(xué)成分鑒定

通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)按上述條件對(duì)平臥菊三七乙酸乙酯部位成分進(jìn)行分析，得到254 nm下的液相色譜圖(圖2A)及ESI負(fù)離子模式下總離子流圖(圖2B)。通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)檢測(cè)得到平臥菊三七提取物乙酸乙酯部位各化學(xué)成分的保留時(shí)間及質(zhì)譜裂解信息，通過(guò)總離子流圖、對(duì)照品總離子流圖及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比分析，對(duì)平臥菊三七提取物乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行確認(rèn)，鑒定得到11個(gè)化合物，見(jiàn)表1。

注：A.HPLC-PDA圖；B.HPLC-Q-TOF-MS總離子流圖。圖2 平平臥菊三七地上部分液質(zhì)聯(lián)用色譜圖

3.3 根據(jù)質(zhì)譜裂解特征鑒定平臥菊三七提取物乙酸乙酯部位的化學(xué)成分

色譜峰1的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z153裂解產(chǎn)生了109、91、81、65、53，符合原兒茶酸的裂解規(guī)律，并和文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，鑒定化合物1為原兒茶酸。

色譜峰3的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z353裂解產(chǎn)生了191、69等碎片離子峰，和綠原酸對(duì)照品裂解規(guī)律一致，鑒定化合物3為綠原酸。通過(guò)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[9-10]，植物中多同時(shí)存在綠原酸的異構(gòu)體，其中包含綠原酸、新綠原酸及隱綠原酸，通過(guò)對(duì)總離子流圖提取353母離子發(fā)現(xiàn)，在洗脫時(shí)間10～25 min，出現(xiàn)3個(gè)綠原酸異構(gòu)體，結(jié)合文獻(xiàn)研究，綠原酸異構(gòu)體在C18柱的洗脫順序?yàn)樾戮G原酸、綠原酸及隱綠原酸。因此，根據(jù)色譜峰的洗脫時(shí)間，鑒定化合物2、3、4分別為新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸，其裂解規(guī)律亦符合文獻(xiàn)報(bào)道。色譜峰5的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z179裂解產(chǎn)生了135、117、107等碎片離子峰，經(jīng)與咖啡酸對(duì)照品比較，裂解規(guī)律一致，故鑒定其為咖啡酸。色譜峰6的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z337裂解產(chǎn)生了191、93、163等碎片離子峰，符合5-O-香豆?？鼘幩岬牧呀庖?guī)律，并和文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，鑒定化合物6為5-O-香豆酰奎寧酸。色譜峰7的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z163裂解產(chǎn)生了191、93、65等碎片離子峰，符合對(duì)香豆酸的裂解規(guī)律，并和文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，鑒定化合物7為對(duì)香豆酸。色譜峰8、9、11的準(zhǔn)分子離子峰都為[M-H]-m/z515，通過(guò)其裂解特征及文獻(xiàn)對(duì)照[9]，鑒定為異綠原酸的異構(gòu)體，其在C18柱洗脫順序?yàn)楫惥G原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)總離子流圖提取515母離子發(fā)現(xiàn)，在洗脫時(shí)間38～48 min，出現(xiàn)3個(gè)異綠原酸的異構(gòu)體，結(jié)合文獻(xiàn)研究及各峰的裂解規(guī)律，鑒定化合物8、9、11分別為異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。色譜峰10的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z609裂解產(chǎn)生了301、463等碎片離子峰，和蘆丁的對(duì)照品裂解規(guī)律一致，鑒定為化合物10為蘆丁。

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用乙醇回流法提取平臥菊三七中的活性成分，進(jìn)一步以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同極性部位，采用體外DPPH自由基清除活性實(shí)驗(yàn)篩選出活性部位為乙酸乙酯部位。因而，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步利用HPLC-MS/MS對(duì)清除DPPH自由基活性較好的乙酸乙酯部位進(jìn)行了成分分析，其中鑒定出11個(gè)化合物，主要是有機(jī)酸類(lèi)成分，包括綠原酸異構(gòu)體和異綠原酸異構(gòu)體，這些成分具有顯著的抗氧化活性，可以判定，綠原酸異構(gòu)體及異綠原酸異構(gòu)體等有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)可能是平臥菊三七提取物抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，但其中也有正丁醇部位含有的一些黃酮類(lèi)成分也具有抗氧化活性，還需要進(jìn)一步研究。