桔梗莖葉總皂苷的提取工藝△

蔣征奎，李曉，王學(xué)方

1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)，河南 鄭州 450000；2.河南省植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，是我國(guó)傳統(tǒng)的四十種大宗中藥材之一，最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性平，味苦、辛，歸肺經(jīng)，具有宣肺利咽、祛痰排膿之功效，臨床常用于咳嗽痰多、咽痛、音啞、胸悶不暢等[1]。桔梗中含有大量的三萜皂苷，生物活性研究表明，桔梗皂苷具有祛痰、抗氧化、保肝、降糖、抑制脂肪吸收、抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用[2-4]。

桔梗為多年生草本植物，一般種植2～3年后收獲地下根，而桔梗莖葉作為非入藥部位多廢棄不用，造成資源浪費(fèi)。有研究表明，桔梗莖葉中總皂苷含量高于桔梗根中總皂苷的含量[5]，與桔梗根相比，桔梗莖葉的祛痰作用在一定范圍內(nèi)隨著濃度的增加明顯增強(qiáng)[6]；桔梗莖葉總皂苷具有明顯的抗腫瘤作用，對(duì)免疫器官也有一定的保護(hù)作用[7]；另外，桔梗莖葉還具有一定的抗炎活性[8]。目前對(duì)桔梗莖葉皂苷的提取未見研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以桔梗莖葉為原料，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化其最佳提取工藝，并進(jìn)一步采用大孔吸附樹脂技術(shù)優(yōu)化了桔梗莖葉皂苷分離純化工藝，旨在為桔梗莖葉的綜合開發(fā)利用與桔梗莖葉皂苷的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀、AUW220D十萬分之一天平(日本島津)；Alltech ELSD2000ES蒸發(fā)光檢測(cè)器(美國(guó)奧泰)；JJ5000A型電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；HGJR-01紅外加熱儀(河南中良科學(xué)儀器有限公司)；LGJ-12低溫冷凍干燥儀(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

桔梗皂苷D對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111851-201406，純度96.2%)；D101、AB-8、HPD750、NKA-9大孔吸附樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；柱層層析硅膠(100～200目)(青島海洋化工廠分廠)；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水、蒸餾水；其他試劑均為分析純。

桔梗莖葉，采自河南三門峽盧氏縣，經(jīng)河南大學(xué)張保國(guó)教授鑒定為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的莖葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 桔?？傇碥张c桔梗皂苷D的測(cè)定

2.1.1 桔梗莖葉總皂苷的測(cè)定 取桔梗莖葉提取物2.0 g，精密稱定，加水50 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取4次，每次用量分別為100、50、50、50 mL，合并正丁醇液，減壓干燥，得桔梗莖葉總皂苷提取物[9]，精密稱定，計(jì)算總皂苷含量。

(1)

2.1.2 桔梗皂苷D的含量測(cè)定 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。理論板數(shù)按桔梗皂苷D峰計(jì)算應(yīng)不低于30 000。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定桔梗皂苷D對(duì)照品18.75 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，溶解后定容至刻度，即得對(duì)照品溶液，其中桔梗皂苷D的質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1。

供試品溶液的制備：精密稱取桔梗莖葉總皂苷提取物0.2 g，至5 mL容量瓶中，加甲醇溶解后，再加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

含量測(cè)定：分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得桔梗皂苷D含量。見圖1～2。

圖1 桔梗皂苷D的HPLC圖

圖2 供試品中桔梗皂苷D的HPLC圖

2.1.3 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察：精密稱取一定量的桔梗皂苷D對(duì)照品，制成桔梗皂苷D的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.25、0.5、0.75、10.0 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，以桔梗皂苷D進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)得其回歸方程：Y=52 308.35X+10 234.54，r=0.998 9，桔梗皂苷在1.5～15 ug線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密稱取桔梗莖葉總皂苷提取物0.2 g，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件，吸取供試品溶液10 uL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算桔梗皂苷D的含量。結(jié)果桔梗皂苷D的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.12 mg·g-1，峰面積RSD為1.35%，表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：供試品溶液分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，吸取該供試品溶液10 uL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算桔梗皂苷D的含量。結(jié)果桔梗皂苷D的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.10 mg·g-1，峰面積RSD為1.82%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率：取已知含量的供試品溶液6份，每份加入實(shí)際質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1的桔梗皂苷D溶液2 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，吸取每份供試品溶液10 uL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加標(biāo)回收率及其RSD。計(jì)算結(jié)果為平均回收率96.50%，RSD為1.95%，說明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選桔梗莖葉總皂苷的提取工藝

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)提取桔梗莖葉的溶媒、溫度、次數(shù)等可能影響桔梗莖葉總皂苷提取的因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)考察，提取溶劑考察了30%、45%、60%、75%的乙醇與水，結(jié)果桔?？傇碥盏奶崛÷什町惒淮?，考慮到經(jīng)濟(jì)環(huán)保因素，選擇水為提取溶劑；提取溫度考察了60、70、80、90、100 ℃(提取溫度采用紅外加熱爐的溫度傳感器進(jìn)行控溫，控溫精度為±2 ℃)，結(jié)果隨著溫度的增加桔?？傇碥盏霓D(zhuǎn)移率逐漸增加，所以選擇80、90、100 ℃ 3個(gè)溫度水平進(jìn)行試驗(yàn)；提取次數(shù)考察了1、2、3、4、5次，結(jié)果提取3次后，桔梗總皂苷的提取率幾乎不增加，所以選擇1、2、3次進(jìn)行下一步的正交試驗(yàn)。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合莖葉類中藥材的提取，以桔梗莖葉總皂苷含量、桔梗皂苷D的含量與轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，以提取溫度(A)、加水量(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)為考察因素，采用四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化桔梗莖葉總皂苷的提取工藝[10]，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

稱取桔梗干燥莖葉，每份30 g，按照表2進(jìn)行試驗(yàn)，提取液減壓濃縮至干，稱質(zhì)量，計(jì)算桔梗莖葉提取物收率，按照2.1方法測(cè)定桔梗莖葉提取物中總皂苷的含量、桔梗皂苷D的含量，并計(jì)算桔梗皂苷D的轉(zhuǎn)移率[11]。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

(2)

因正交表中無空列以計(jì)算試驗(yàn)誤差項(xiàng)，每次試驗(yàn)均各重復(fù)3次。

表3 總皂苷含量方差分析結(jié)果

表4 桔梗皂苷D的含量方差分析結(jié)果

表5 桔梗皂苷D轉(zhuǎn)移率的方差分析結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析結(jié)果可知，在考察的因素水平范圍內(nèi)，對(duì)總皂苷含量的影響大小為D>B>C>A，其中提取次數(shù)影響較大，且有顯著性影響，其次為溶劑用量、提取時(shí)間、提取溫度，最佳提取條件為A3B3C3D2，即100 ℃，12倍量水，每次2 h，提取2次；對(duì)桔梗皂苷D含量的影響大小為D>A>B>C，其中提取次數(shù)影響最大，且有顯著性影響，其次為提取溫度、溶劑用量、提取時(shí)間，最佳提取條件為A3B1C1D2，即100 ℃，8倍量水，每次1 h，提取2次；對(duì)桔梗皂苷D轉(zhuǎn)移率的影響大小為D>A>C>B，其中提取次數(shù)影響最大，且有顯著性影響，其次為提取溫度、提取時(shí)間、溶劑用量，最佳提取條件為A3B1C2D2，即100 ℃，8倍量水，每次1.5 h，提取2次；綜上，結(jié)合成本和提取效率，確定優(yōu)選出最佳方案為A3B2C2D2即100 ℃，10倍量水，每次1.5 h，提取2次。

2.3 提取驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取桔梗干燥莖葉3份，每份100 g，按照優(yōu)選的工藝條件，即10倍量的水提取2次，提取溫度100 ℃，每次1.5 h，提取液減壓濃縮至干，稱重，計(jì)算桔梗莖葉提取物收率，并測(cè)定干膏中總皂苷的含量、桔梗皂苷D的含量，并計(jì)算桔梗皂苷D的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表6。由結(jié)果可知，平均浸膏得率為41.4%，桔梗莖葉總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.16%，桔梗皂苷D的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.08 mg·g-1，轉(zhuǎn)移率為66.08%，說明該提取工藝穩(wěn)定、可靠。

表6 提取驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 桔梗莖葉總皂苷的純化

經(jīng)過提取得到的桔梗莖葉提取物中含有大量的雜質(zhì)，很大程度上影響了對(duì)藥物療效的評(píng)價(jià)、理化參數(shù)的測(cè)定等更深層次的研究，為了達(dá)到去除雜質(zhì)、富集有效成分的目的，采用大孔吸附樹脂對(duì)桔梗莖葉總皂苷進(jìn)行純化。

2.4.1 樣品溶液的制備 按照已優(yōu)選出的最佳提取工藝制備藥液，并測(cè)定桔梗莖葉總皂苷的含量。

2.4.2 樹脂的預(yù)處理 為除去樹脂中的部分雜質(zhì)，試驗(yàn)前先將大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡，充分溶脹24 h，濕法裝柱(徑高比1∶7)，先用95%的乙醇清洗，直至洗出液加等量的蒸餾水不產(chǎn)生白色渾濁為止，再用蒸餾水沖洗，至無醇味且水液澄清，則預(yù)處理完畢，備用。

2.4.3 大孔吸附樹脂的篩選[12]

2.4.3.1 采用動(dòng)態(tài)-吸附試驗(yàn)篩選樹脂 準(zhǔn)確稱取已處理好的4種大孔樹脂，分別為D101、AB-8、HPD750、NKA-9各50 g，蒸餾水濕法上柱(徑高比1∶7)。取經(jīng)離心處理的桔梗莖葉水提取液100 mL上柱，質(zhì)量濃度為每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g，以1.0 mL·min-1的流速吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測(cè)定桔梗莖葉總皂苷的量，并計(jì)算各樹脂的動(dòng)態(tài)吸附率，結(jié)果見表7。

動(dòng)態(tài)吸附率(%)=(上柱液中總皂苷量-流出液中總皂苷量)/上柱液中總皂苷量×100%

(3)

2.4.3.2 動(dòng)態(tài)-解吸試驗(yàn)篩選樹脂 將2.4.3.1中充分吸附后的樹脂用蒸餾水洗脫至無色，改用70%乙醇洗脫至無色，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法測(cè)定桔梗莖葉總皂苷的量，并計(jì)算各樹脂的動(dòng)態(tài)解吸率。結(jié)果見表7。

(4)

表7 不同型號(hào)大孔吸附樹脂的篩選試驗(yàn)結(jié)果 %

從工藝角度出發(fā)，適宜的吸附樹脂應(yīng)具有良好的可逆性，即良好的吸附性能與解吸性能。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，雖然AB-8的吸附能力沒有D101的強(qiáng)，但是其解吸能力高于D101很多。綜合評(píng)價(jià)，分離純化桔梗莖葉總皂苷的最佳樹脂可選擇AB-8。

2.4.4 AB-8大孔吸附樹脂純化工藝參數(shù)

2.4.4.1 吸附因素的考察 上樣量對(duì)吸附效果的考察：稱取6份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經(jīng)離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)25、50、75、100、125、150 mL，以1.0 mL·min-1的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測(cè)定桔梗莖葉總皂苷的量，并計(jì)算不同上樣量的吸附率，結(jié)果見圖3。根據(jù)圖3可知，隨著上樣量的增加，樹脂的吸附率先上升后下降。上樣量偏高，會(huì)造成樹脂的過飽和不吸附，處理量小，上樣量偏低，造成樹脂的不完全利用，浪費(fèi)資源。故50 g樹脂上樣100 mL藥液比較適宜，則確定上樣量為桔梗莖葉提取物量與樹脂用量比為0.8∶1。

藥液濃度對(duì)吸附效果的考察：稱取6份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經(jīng)離心處理的桔梗莖葉水提取液100 mL，藥液質(zhì)量濃度分別為每mL含桔梗莖葉提取物0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，以1.0 mL·min-1的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測(cè)定桔梗莖葉總皂苷的量，并計(jì)算不同藥液濃度的吸附率，結(jié)果見圖4。根據(jù)圖4可知，吸附量隨藥液濃度的增大而增加，但吸附殘液中桔梗莖葉總皂苷的含量也隨藥液濃度的增大而增加，從而引起成分的流失。藥液濃度越大，吸附的雜質(zhì)含量也越高，不利于總皂苷的分離純化。因此，藥液濃度選擇每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g為最佳，總皂苷的吸附量可達(dá)95%以上。

圖3 上樣量對(duì)吸附效果的考察結(jié)果

圖4 藥液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的考察結(jié)果

流速對(duì)吸附效果的考察：稱取4份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經(jīng)離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)100 mL，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL·min-1的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測(cè)定桔梗莖葉總皂苷的量，并計(jì)算不同流速的吸附率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，0.5、1.0 mL·min-1的流速的吸附率變化不大，1.5、2.0 mL·min-1的流速的吸附率明顯下降。由于流速過慢，耗時(shí)增加，效率降低。綜合各因素考慮，控制流速為1.0 mL·min-1為宜。

圖5 流速對(duì)吸附效果的考察結(jié)果

2.4.4.2 洗脫條件的優(yōu)化 洗脫液濃度的考察：稱取5份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經(jīng)離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)100 mL，控制流速為1.0 mL·min-1。先用蒸餾水將已吸附飽和的樹脂柱洗至流出液接近于無色，再分別用35%、55%、75%、95%乙醇洗脫樹脂柱，收集洗脫液，減壓濃縮至干，計(jì)算桔梗莖葉總皂苷提取物的收率，按上述2.1方法，測(cè)定桔梗莖葉總皂苷和桔梗皂苷D的含量，結(jié)果見表8。75%、95%乙醇的洗脫效果最好，55%乙醇洗脫次之，35%的洗脫能力最弱。其中，75%乙醇洗脫部分總皂苷和桔梗皂苷D的含量較95%乙醇高，說明75%乙醇可以將樣品中的皂苷類成分全部洗脫下來，且雜質(zhì)比95%乙醇少，因此選用75%乙醇作為洗脫劑。

表8 洗脫液濃度的考察結(jié)果

洗脫液體積的考察：稱取5份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經(jīng)離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)100 mL，控制流速為1.0 mL·min-1。先用蒸餾水將已吸附飽和的樹脂柱洗至流出液接近于無色，再分別用3、4、5、6、7、8 BV的75%乙醇洗脫樹脂柱，收集洗脫液，減壓濃縮至干，計(jì)算桔梗莖葉總皂苷提取物的收率，按上述2.1方法，測(cè)定桔梗莖葉總皂苷和桔梗皂苷D的含量，結(jié)果見表9。5 BV的75%乙醇洗脫液就可以把樹脂上80%以上的總皂苷解吸下來，故確定洗脫液為5 BV的75%乙醇。

表9 洗脫液體積的考察結(jié)果

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果分析，優(yōu)化桔梗莖葉總皂苷純化工藝參數(shù)：最佳工藝提取藥液離心后濃縮至1.0 g生藥/mL，通過AB-8型大孔吸附樹脂，上樣量為桔梗莖葉提取物量：樹脂用量=0.8∶1，流速為1.0 mL·min-1，用5 BV的75%乙醇洗脫。

2.5 桔梗莖葉總皂苷提取純化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取桔梗干燥莖葉3份，每份100 g，加10倍量的水提取2次，提取溫度100 ℃，每次1.5 h，提取液減壓濃縮至每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g，離心后上清液上AB-8型大孔吸附樹脂，上樣量為桔梗莖葉提取物量∶樹脂用量=0.8∶1，流速1.0 mL·min-1，先用蒸餾水將已吸附飽和的樹脂柱洗至流出液接近于無色，用5 BV75%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥，計(jì)算桔梗莖葉總皂苷提取物的收率，測(cè)定桔梗莖葉總皂苷和桔梗皂苷D的含量，結(jié)果見表10。由結(jié)果可知，桔梗莖葉總皂苷的平均得率為9.06%，總皂苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.18%，桔梗皂苷D的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.18 mg·g-1，說明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

表10 純化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

桔梗莖葉為中藥桔梗的非藥用部位，本研究以桔梗莖葉為原料，以桔梗莖葉總皂苷含量、桔梗皂苷D含量為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化其最佳提取工藝，并進(jìn)一步采用大孔吸附樹脂技術(shù)優(yōu)化了桔梗莖葉皂苷的分離純化工藝，所得桔梗莖葉總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.18%，桔梗皂苷D的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.18 mg·g-1，較大孔吸附樹脂純化前樣品中總皂苷和桔梗皂苷D的含量提高5倍以上，為桔梗莖葉總皂苷進(jìn)一步的藥效及機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也為合理利用桔梗資源與綜合開發(fā)利用提供參考。