響應(yīng)曲面法優(yōu)化馬齒莧中總生物堿的提取工藝△

梁艷妮，李若嵐，唐志書(shū)，千磊，張東博，劉世軍，宋忠興，王征

陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083

馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分，為草本藥食同源植物，全國(guó)均有分布，具有清熱解毒、涼血止血、止痢作用[1]。臨床常用于熱毒血痢、癰腫疔瘡、丹毒、蛇蟲(chóng)咬傷、濕疹、便血、痔血、崩漏下血等[2-3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分、藥理作用進(jìn)行研究，馬齒莧主要含有生物堿類、萜類、香豆素類、黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油及多糖等化學(xué)成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、降血脂血糖、抗腫瘤等藥理作用[4-6]。馬齒莧生物堿能有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝[7]。優(yōu)化馬齒莧生物堿的提取工藝對(duì)于進(jìn)一步的藥理作用研究具有重要意義。

目前在生物堿提取工藝中使用較多的方法為超聲波法和加熱回流法[8-10]。大部分生物堿難溶或不溶于水，與酸結(jié)合后易溶于水和醇，可采用醇類溶劑提取后配合酸水溶解，堿化游離后有機(jī)溶劑萃取得到總生物堿。Box-Behnken效應(yīng)面法將各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系用多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，精確表述因素與響應(yīng)值的關(guān)系[11]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬齒莧總生物堿的乙醇回流粗提取工藝，為其馬齒莧生物堿的分離純化提供參考。

1 材料

UV-2600型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；GB204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；FA2004B型萬(wàn)分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；VaCo5低溫冷凍干燥儀(Zibrus Technology)；HH-2型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；FE-1000AD固體粉碎機(jī)(天津鑫博得儀器有限公司)。

咖啡因?qū)φ掌?四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq16052505，純度：HPLC≥98%)；所用試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

馬齒莧(批號(hào)：20171101，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)為馬齒莧科植物馬齒莧PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 參照扈本荃等[12]馬齒莧總生物堿的含量測(cè)定，準(zhǔn)確稱取咖啡因?qū)φ掌?0 mg，放置于25 mL容量瓶中，加入少量無(wú)水乙醇使其溶解后定容，搖勻，備用。

2.1.2 溴甲酚綠緩沖溶液的配制 準(zhǔn)確稱取溴甲酚綠0.125 mg，加入250 mL燒杯中，用5%的NaOH溶液12.5 mL使其溶解，再準(zhǔn)確稱取鄰苯二甲酸氫鉀2.5 g，加入適量蒸餾水使其溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容后調(diào)節(jié)pH至4.4，備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確量取0、1、2、3、4、5、6 mL 2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL溴甲酚綠緩沖溶液和2 mL無(wú)水乙醇溶液，用蒸餾水定容至刻度線后搖勻放置15 min。以629 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定對(duì)照品溶液的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得回歸方程為Y=2.607X+0.015 2，r=0.999 5。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度范圍40～240 mg·mL-1線性良好。

2.1.4 供試品溶液的配制 將干燥馬齒莧藥材粉碎，精確稱取馬齒莧粗粉30 g，在考察提取因素條件下(回流時(shí)間、回流溫度和料液比)加入95%乙醇于500 mL圓底燒瓶加熱回流提取，保持微沸，共提取2次，抽濾，將濾液合并，回收乙醇后將所得浸膏于燒杯中蒸餾水超聲溶解。用鹽酸調(diào)節(jié)提取液pH=3～4，攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，使用乙酸乙酯以體積比為1∶1萃取3次，合并乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯。再將水相用氨水調(diào)節(jié)pH=10～11，攪拌均勻后，二氯甲烷以體積比1∶1萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，回收二氯甲烷后得馬齒莧總生物堿，精密稱質(zhì)量。

將提取得到的馬齒莧總生物堿溶于10 mL無(wú)水乙醇，定容于25 mL容量瓶中搖勻，備用。按照2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，根據(jù)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總生物堿的提取率。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 回流時(shí)間對(duì)馬齒莧總生物堿提取率的影響 精確稱取干燥馬齒莧粉末30 g于500 mL圓底燒瓶中，以95%乙醇為提取試劑，固定回流提取溫度為75 ℃，料液比為1∶7，分別考察回流時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)馬齒莧中總生物堿的提取率，見(jiàn)圖1。

圖1 回流時(shí)間對(duì)總生物堿提取率的影響

從圖1可以看出馬齒莧中生物堿的提取率隨回流時(shí)間的增加先增后減，當(dāng)回流時(shí)間在1～2.5 h時(shí)提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在2.5 h時(shí)達(dá)到最大提取率，為0.223%；當(dāng)回流時(shí)間在2.5～3 h時(shí)提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜上所述，可確定當(dāng)回流時(shí)間為2.5 h，此時(shí)生物堿的得率最高。

2.2.2 回流溫度對(duì)馬齒莧總生物堿提取率的影響 精確稱取干燥馬齒莧粉末30 g于500 mL圓底燒瓶中，以95%乙醇為提取試劑，固定回流提取時(shí)間為2 h，料液比為1∶7，分別考察回流溫度為70、75、80、85、90 ℃時(shí)馬齒莧中總生物堿的提取率，見(jiàn)圖2。

圖2 回流溫度對(duì)生物堿提取率的影響

從圖2可知，當(dāng)回流溫度在70～80 ℃時(shí)，馬齒莧中生物堿的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在80 ℃時(shí)可達(dá)到最大提取率為0.199%；當(dāng)回流溫度在80～90 ℃時(shí)提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜上所述，可確定回流溫度為80 ℃，此時(shí)生物堿的得率最高。

2.2.3 料液比對(duì)馬齒莧總生物堿提取率的影響 精確稱取干燥馬齒莧粉末30 g于500 mL圓底燒瓶中，以95%乙醇為提取試劑，固定回流提取時(shí)間為2 h，提取溫度為75 ℃，分別考察料液比為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10時(shí)馬齒莧中總生物堿的提取率，見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)生物堿提取率的影響

從圖3可知，當(dāng)料液比在1∶6～1∶8時(shí)生物堿提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，1∶8時(shí)最大提取率為0.204%；當(dāng)料液比在1∶8～1∶10時(shí)生物堿提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜上所述，可確定料液比為1∶8，此時(shí)生物堿的得率最高。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 響應(yīng)模型建立與分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選的提取時(shí)間、提取溫度和料液比，采用Design-Expert.V8.0.6軟件中Box-Behnken模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)組，以回流時(shí)間(A)、回流溫度(B)、料液比(C)3個(gè)因素為自變量，將馬齒莧總生物堿提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

注：**P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化 通過(guò)多元回歸方程作三維效應(yīng)曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4～6可以直觀分析三個(gè)因素之間的交互作用以及對(duì)總生物堿提取率的影響。

圖4 提取時(shí)間與提取溫度對(duì)馬齒莧生物堿提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖5 提取時(shí)間與料液比對(duì)對(duì)馬齒莧生物堿提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 提取溫度與料液比對(duì)馬齒莧生物堿提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖4提取時(shí)間與提取溫度交互作用顯示，提取時(shí)間變化曲面比提取溫度變化曲面陡峭；等高線圖呈橢圓形表明二者交互作用顯著。由圖5提取時(shí)間與料液比交互作用顯示，料液比變化曲面比提取時(shí)間曲面稍陡峭；等高線圖呈橢圓形表明二者交互作用顯著。由圖6料液比與提取溫度交互作用顯示，料液比變化曲面比提取溫度變化曲面陡峭，二者交互作用不顯著。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果確定回流提取馬齒莧總生物堿的最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間2 h，提取溫度66.75 ℃，料液比1∶9，在該條件下馬齒莧中總生物堿的提取率可達(dá)到0.207%。實(shí)際操作調(diào)整為提取時(shí)間2 h，提取溫度66 ℃，料液比1∶9，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得馬齒莧中總生物堿提取率為0.199%，與模型預(yù)測(cè)提取率十分接近，說(shuō)明用響應(yīng)面法優(yōu)選的提取條件可靠。

2.4 DPPH·清除活性

將提取的馬齒莧生物堿配成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的甲醇溶液。移取上述生物堿甲醇溶液2 mL置于100 mL的容量瓶中，甲醇定容，進(jìn)一步分別稀釋為0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1的樣品溶液。

按照陳智坤等[13]清除DPPH·的方法，向6支試管中分別加入2 mL 0.048 mg·mL-1的DPPH·甲醇溶液和2 mL系列濃度的馬齒莧生物堿甲醇溶液，充分混合，室溫避光反應(yīng)30 min后測(cè)定在517 nm處的吸光度A實(shí)驗(yàn)；以等體積的甲醇代替馬齒莧生物堿溶液，同法操作，測(cè)定吸光度為A空白。每組平行測(cè)量3次，取其平均值。DPPH·清除能力計(jì)算公式為：

清除率(%)=(A空白-A實(shí)驗(yàn))/A空白×100%

(1)

圖7 不同質(zhì)量濃度馬齒莧總生物堿對(duì)DPPH·的清除作用

從圖7可看出馬齒莧生物堿對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度增大而增強(qiáng)，在0.01～0.20 mg·mL-1呈一定量效關(guān)系，當(dāng)馬齒莧總生物堿質(zhì)量濃度為0.20 mg·mL-1時(shí)清除率達(dá)84.40%。

3 討論

在提取工藝參數(shù)的優(yōu)化中，影響因素和響應(yīng)值之間往往具有高度非線性關(guān)系，響應(yīng)面法通過(guò)設(shè)計(jì)有限次數(shù)試驗(yàn)，建立包括各顯著因素一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的多元二次模型，擬合因素與響應(yīng)值間的全局函數(shù)關(guān)系。通過(guò)對(duì)影響響應(yīng)值的各因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，快速有效地確定多因素影響的最佳條件，精度高，預(yù)測(cè)性好。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行馬齒莧總生物堿的回流提取工藝優(yōu)化，建立的二次多項(xiàng)回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，擬合度好，能夠準(zhǔn)確地反映萃取前95%乙醇回流提取時(shí)料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)馬齒莧總生物堿提取率的影響。利用此模型得到的馬齒莧總生物堿乙醇回流提取最佳條件為料液比1∶9，提取時(shí)間2 h，提取溫度66 ℃，生物堿提取率為0.207%。由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，Box-Behnken效應(yīng)面法得到的理論優(yōu)化結(jié)果與實(shí)驗(yàn)值接近，說(shuō)明所采用的響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果可靠。采用非線性擬合模型接近客觀事實(shí)，效應(yīng)面三維圖使因素對(duì)指標(biāo)的影響更為直觀、方便，實(shí)驗(yàn)精度高。馬齒莧生物堿對(duì)DPPH·的清除能力具有濃度依賴性，總生物堿濃度在0.2 mg·mL-1時(shí)清除率可達(dá)84.40%。有關(guān)馬齒莧生物堿的抗氧化活性還需進(jìn)一步考察。