安石榴苷在Caco-2細胞模型的腸吸收機制△

周本宏，李曠宇，姜姍，吳玥，蘭昱

1.武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430072

石榴皮是石榴科石榴PunicagranatumL.的干燥果皮，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲的功效，是一種常見的中藥材。安石榴苷(Punicalagin)是石榴皮中主要的鞣花鞣質(zhì)(Ellagitannin)類成分，已有研究表明，安石榴苷具有顯著的藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等[1-7]。Caco-2細胞來源于人結(jié)腸腺腫瘤，可以在體外培養(yǎng)的狀態(tài)下自發(fā)地發(fā)生分化并形成單層的上皮樣細胞，與腸道上皮細胞在形態(tài)學(xué)和生理功能上具有相似性，近30年來，該模型被廣泛地用于研究藥物的轉(zhuǎn)運吸收[8]。現(xiàn)階段，對安石榴苷等鞣質(zhì)類成分的研究主要集中在其藥理活性及作用機制，而對于其吸收轉(zhuǎn)運的研究較少，本實驗選用Caco-2細胞模型來研究安石榴苷的腸吸收機制，為安石榴苷的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

UV-1800型紫外分光光度計(島津，日本)；Millcell ERS-2跨膜電阻儀(Millpore，美國)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus，日本)；酶標(biāo)儀(Perkin Elmer，美國)；LC-20AT高效液相色譜儀(島津，日本)；實驗室pH計(Mettler Toledo，瑞士)；HZ-301B恒溫搖床(一恒科學(xué)儀器有限公司)；transwell小室(Corning，美國)。

安石榴苷對照品(成都曼斯特，批號：16031501，純度≥98%)；維拉帕米，環(huán)孢菌素A(阿拉丁)；堿性磷酸酶測試盒(南京建成)；DMEM培養(yǎng)基，PBS，HBSS(Hyclone)；胎牛血清非必需氨基酸，胰酶(Gibco)；青-鏈霉素(吉諾生物)；CCK-8試劑盒(日本同仁研究所)；乙腈(美國Tedia，色譜純)；甲醇，三氟乙酸(德國Merck，色譜純)；EDTA-Na2(Biosharp)；MillQ超純水。

實驗所用Caco-2細胞株細胞源自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，代數(shù)在35～50代。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)，0.1%三氟乙酸水溶液(B)[10]；洗脫條件：0～5 min，92%～70% B；5～11 min，70% B；11～11.5 min，70%～55% B；11.5～18 min，55% B；流速：1.00 mL·min-1；檢測波長：378 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20.00 μL。

1.3 細胞毒性實驗

本實驗以CCK-8法進行細胞實驗，操作如下：精密稱定安石榴苷對照品，用HBSS配制，安石榴苷的濃度分別為100.00、150.00、200.00、250.00、300.00、350 μmol ·L-1；另取培養(yǎng)于96孔板中生長狀態(tài)良好的細胞，向每孔加入100 μL不同濃度安石榴苷的HBSS，每個藥物濃度設(shè)置6個復(fù)孔，1個對照孔，1個空白孔，孵育4 h后吸棄含藥HBSS，用PBS洗滌細胞；最后向每孔加入100 μL含CCK-8試劑的空白培養(yǎng)基(每100 μL培養(yǎng)基含10 μL CCK-8試劑)，2 h后用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度(A)值，檢測波長為450 nm。按照公式(1)計算細胞存活率。

(1)

式中：As表示實驗孔的吸光度值；Ac表示對照孔的吸光度值；Ab表示空白孔的吸光度值。

1.4 Caco-2細胞模型的建立與驗證

1.4.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察 將細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，定期更換培養(yǎng)基，并于第4天、第7天、第14天、第21天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4.2 堿性磷酸酶的測定 取培養(yǎng)第4天、第7天、第14天及第21天的Transwell小室，分別吸收上室(AP側(cè))和下室(BL側(cè))的培養(yǎng)基為測定管，標(biāo)準(zhǔn)管中加入等體積酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，分別依次加入緩沖液、基質(zhì)液及顯色劑后于520 nm測定A值，按試劑盒上的說明簡化得公式(2)，計算其堿性磷酸酶的活力。

(2)

1.4.3 細胞電阻值的測定 用Millcell跨膜電阻儀分別測定第3天、第5天、第7天、第10天、第14天、第18天、第21天Transwell小室中細胞的跨上皮電阻(TEER)，將電極置于HBSS溶液中平衡后，將電極的長端置于下室、短端置于上室細胞側(cè)，讀取電阻值，記錄數(shù)據(jù)并按公式(3)計算細胞TEER值。

單位面積TEER(Ω·cm-2)=R測定×A

(3)

式中：R測定表示測定電阻值，A為有效膜面積。

1.4.4 標(biāo)志性滲透物的檢測 本實驗選用酚紅作為標(biāo)志性滲透物來檢測培養(yǎng)21 d后的Caco-2細胞單層膜的完整性及滲透率。取Caco-2細胞吸取AP及BL側(cè)的培養(yǎng)基，在AP側(cè)加入0.2 mL酚紅溶液、BL側(cè)加入0.6 mL空白HBSS溶液，分別于第30、90、120、150、180 min吸取下室溶液，測定酚紅的含量，按公式(4)計算滲透率?？瞻仔∈覟榭瞻讓φ战M。

(4)

式中：C1為對側(cè)酚紅濃度；C0為酚紅的初始濃度。

1.5 轉(zhuǎn)運實驗

取培養(yǎng)21 d、TEER值大于500 Ω·cm-2、堿性磷酸酶與酚紅滲透率均達標(biāo)[10]的Caco-2細胞，用37 ℃預(yù)熱的HBSS溶液輕輕洗滌細胞2次，再加0.20 mL HBSS溶液至AP側(cè)、0.60 mL HBSS溶液至BL側(cè)，于37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min，然后吸棄HBSS溶液；BL到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運：向BL側(cè)分別加入安石榴苷HBSS溶液0.60 mL，向AP側(cè)加入0.20 mL空白HBSS溶液，在AP側(cè)取樣500 μL，取樣后補足空白HBSS；AP到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運：向AP側(cè)分別加入安石榴苷HBSS溶液0.20 mL，向BL側(cè)加入0.60 mL空白HBSS溶液，在BL側(cè)取樣500 μL，取樣后補足空白HBSS。轉(zhuǎn)運實驗37 ℃搖床上進行，轉(zhuǎn)速為55 r ·min-1。取樣500 μL，加入500 μL甲醇，3000 r·min-1離心5 min，取上清液20 μL進HPLC分析后測得藥物的累積轉(zhuǎn)運量。

1.5.1 不同時間藥物的累積轉(zhuǎn)運量 向AP側(cè)或BL側(cè)分別加入150.00、200.00、250.00、300.00、350 μmol·L-1的安石榴苷HBSS溶液，向BL側(cè)或AP側(cè)加入空白HBSS，分別于60、90、120、150、180 min在AP側(cè)或BL側(cè)取樣，取樣后補足空白HBSS，樣品預(yù)處理后按照1.2項下條件用HPLC進行分析。

1.5.2 濃度對藥物轉(zhuǎn)運的影響 向AP側(cè)或BL側(cè)分別加入150.00、200.00、250.00、300.00、350 μmol·L-1的安石榴苷HBSS溶液，向BL側(cè)或AP側(cè)加入空白HBSS，180 min后在AP側(cè)或BL側(cè)取樣，樣品預(yù)處理后按照1.2項下條件用HPLC進行分析。

1.5.3溫度對藥物轉(zhuǎn)運的影響 向AP側(cè)或BL側(cè)分別加入250.00、300.00、350 μmol·L-1的安石榴苷HBSS溶液，向BL側(cè)或AP側(cè)加入空白HBSS，180 min后在AP側(cè)或BL側(cè)取樣，轉(zhuǎn)運實驗分別在4 ℃和37 ℃條件下進行，樣品預(yù)處理后按照1.2項下條件用HPLC進行分析。

1.5.4 pH值對藥物轉(zhuǎn)運的影響 向AP側(cè)或BL側(cè)分別加入pH值分別為6.0和7.4的安石榴苷HBSS溶液(空白HBSS溶液pH為7.4)，安石榴苷的濃度為250.00、300.00、350 μmol·L-1，向BL側(cè)或AP側(cè)加入空白HBSS，180 min后在AP側(cè)或BL側(cè)取樣，樣品預(yù)處理后按照1.2項下條件用HPLC進行分析。

1.5.5 P-gp抑制劑對藥物轉(zhuǎn)運的影響 為了研究P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)對于安石榴苷腸吸收可能存在的作用，選用鹽酸維拉帕米和環(huán)孢菌素兩種不同的P-糖蛋白抑制劑(鹽酸維拉帕米的濃度為100.00 μmol·L-1、環(huán)孢菌素的濃度為10.00 μmol·L-1)。轉(zhuǎn)運實驗前在小室中加入P-糖蛋白抑制劑，向AP側(cè)或BL側(cè)分別加入濃度250.00、300.00、350 μmol·L-1的安石榴苷HBSS溶液，向BL側(cè)或AP側(cè)加入空白HBSS，180 min后在AP側(cè)或BL側(cè)取樣，樣品預(yù)處理后按照1.2項下條件用HPLC進行分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

按照公式(5)、(6)，計算安石榴苷表觀滲透系數(shù)(Apparent permeability，Papp)值和外排率(Efflux ratio，ER)值。

(5)

(6)

2 結(jié)果

2.1 HPLC方法學(xué)考察

取安石榴苷母液，將母液稀釋至10.00 mL棕色容量瓶中，濃度分別為1.25、2.50、5.00、7.50、10.00 μmol·L-1。每個濃度按照1.2項下色譜條件進樣，每個濃度進樣3次，得出峰面積值，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積(安石榴苷α、β峰面積之和)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=3 833.9X-1 363.9，線性范圍1.25～12.50 μmol·L-1，r=0.999 7。取對照品母液，稀釋高、中、低(2.50、5.00、10.00 μmol·L-1)3個不同濃度，按照1.2項下色譜條件每隔2 h進樣1次，平行進樣5次，計算日內(nèi)精密度值，按照日間精密度的測定方法連續(xù)測定5 d，得出日間精密度值。日內(nèi)精密度值分別為2.07%、2.32%、2.98%，日間精密度值分別為2.89%、2.95%、2.31%?？疾?.00 μmol·L-1安石榴苷在4 ℃和37 ℃條件下180 min內(nèi)的穩(wěn)定性，RSD值分別為0.59%和2.61%。2.50、5.00、10.00 μmol·L-13種不同濃度安石榴苷的回收率分別為98.36%、97.42%、101.14%。安石榴苷有α和β兩種同分異構(gòu)體，其專屬性結(jié)果如圖1所示。綜上可知本實驗所建立的方法符合生物樣品測定要求。

注：A.空白溶劑；B.安石榴苷對照品；C.HPLC分析樣品；1.安石榴苷α；2.安石榴苷β。圖1 安石榴苷專屬性色譜圖

2.2 細胞毒性實驗

表1結(jié)果顯示，不同濃度安石榴苷的細胞存活率均在95%以上，實驗所用的各濃度的安石榴苷對細胞沒有毒性。

表1 不同濃度安石榴苷的細胞毒性

2.3 Caco-2細胞模型驗證

2.3.1 細胞形態(tài)學(xué)特征 到第14天時，顯微鏡下可觀察到細胞連接緊密，開始呈上皮樣分化，形成一層完整的單層膜。

2.3.2 堿性磷酸酶的測定 如圖2所示，AP側(cè)堿性磷酸酶值隨著時間變化增長迅速，而BL側(cè)增長緩慢，第21天時，AP側(cè)的堿性磷酸酶值是BL側(cè)的10倍以上，單層膜的極性符合要求。

圖2 不同生長時期Caco-2細胞堿性磷酸酶活性

2.3.3 細胞電阻值的測定 圖3所示，細胞電阻值隨時間變化而增加，第21天時，細胞電阻值大于500 Ω·cm-2，單層膜細胞連接緊密。

圖3 不同生長時期Caco-2細胞跨膜電阻值

2.3.4 標(biāo)志性滲透物的檢測 如圖4所示，180 min內(nèi)細胞單層膜酚紅的透過率小于0.05%，單層膜細胞完整性良好。

圖4 Caco-2細胞模型的酚紅透過率

2.4 轉(zhuǎn)運實驗

2.4.1 不同時間藥物的累積轉(zhuǎn)運量 不同時間AP側(cè)到BL側(cè)的藥物積累轉(zhuǎn)運量和BL到AP側(cè)藥物的累積轉(zhuǎn)運量如圖5所示，各濃度AP側(cè)至BL側(cè)和BL到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運量均隨時間的增加而呈現(xiàn)近線性效應(yīng)。

2.4.2 濃度對藥物轉(zhuǎn)運的影響 不同藥物濃度對于藥物Papp的影響結(jié)果如圖6所示。濃度為150.00、200、250.00、300.00、350 μmol·L-1的安石榴苷ER值分別為(1.81±0.03)、(2.00±0.05)、(2.18±0.06)、(2.30±0.08)、(2.51±0.32)，各濃度ER值均接近2或大于2。

注：與Papp(BL-AP)相比，*P<0.05。圖5 不同時間各濃度安石榴苷在Caco-2細胞的累積轉(zhuǎn)運量

注：與Papp(BL-AP)相比，*P<0.05。圖6 濃度對安石榴苷轉(zhuǎn)運的影響

2.4.3 溫度對藥物轉(zhuǎn)運的影響 如圖7所示，4 ℃時250.00 μmol·L-1、300.00 μmol·L-1、350 μmol·L-1的安石榴苷從AP側(cè)到BL側(cè)和從BL側(cè)到AP側(cè)的Papp比37℃均有降低。各濃度的ER值分別為(2.19±0.14)、(2.15±0.10)、(2.29±0.14)。

注：與37 ℃測定的Papp相比，*P<0.05。圖7 溫度對安石榴苷轉(zhuǎn)運的影響

2.4.4 pH值對藥物轉(zhuǎn)運的影響 pH值對與安石榴苷Papp的影響如圖8所示，與pH為7.4時相比，pH值為6.0時安石榴苷從AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運量增多，而BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運量無明顯變化。pH值6.0條件下，250.00、300.00、350 μmol·L-1的安石榴苷的ER值分別為(1.37±0.03)、(1.18±0.04)、(1.46±0.04)。

2.4.5 P-gp抑制劑對藥物轉(zhuǎn)運的影響 P-gp抑制劑對安石榴苷轉(zhuǎn)運的影響如圖9所示，與對照組相比，加抑制劑時250.00、300.00、350 μmol·L-1的安石榴苷從AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運增加，BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運減少。維拉帕米組的ER值分別為(0.94±0.02)、(0.67±0.02)、(0.54±0.02)；環(huán)孢菌素A組的ER值分別為(1.18±0.04)、(0.76±0.02)、(0.54±0.02)。

注：與pH為7.4測定的Papp相比，*P<0.05。圖8 pH對安石榴苷轉(zhuǎn)運的影響

注：與對照組的Papp相比，*P<0.05。圖9 P-糖蛋白抑制劑對安石榴苷轉(zhuǎn)運的影響

3 討論

Caco-2模型功能的發(fā)揮與其細胞代數(shù)有著很大的關(guān)聯(lián)，本實驗選用的細胞確定代數(shù)在35～50代。同時，Caco-2細胞模型的建立需要多項指標(biāo)的監(jiān)控，主要是細胞的極性和單層膜的完整性[11]，本實驗通過觀察細胞的形態(tài)學(xué)特征、測定細胞堿性磷酸酶活性、不同生長期的細胞跨膜電阻值及標(biāo)志性滲透物的滲透率驗證Caco-2細胞模型，篩選各指標(biāo)均合格的細胞進行實驗。

本實驗建立了HPLC測定安石榴苷的方法，采用Caco-2細胞模型研究時間、濃度、溫度、pH、P-gp抑制劑對安石榴苷轉(zhuǎn)運的影響并推測安石榴苷的腸轉(zhuǎn)運方式。通常情況下[12]，藥物Papp值大于1×10-6cm·s-1時，可認(rèn)為該藥物吸收良好，150～350 μmol·L-1的安石榴苷的Papp值在2.3×10-6～3.2×10-6cm·s-1，安石榴苷易被Caco-2細胞吸收。不同濃度的安石榴苷從AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運和從BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運均不具有濃度依賴性；不同濃度的安石榴苷Papp(BL-AP)值大于Papp(AP-BL)值，安石榴苷在Caco-2細胞的外排量大于攝入量，且各濃度安石榴苷ER值均大于1.5，可以認(rèn)為安石榴苷的轉(zhuǎn)運方式以主動轉(zhuǎn)運為主；37 ℃條件下，安石榴苷的雙向轉(zhuǎn)運均多于4 ℃時的轉(zhuǎn)運，進一步印證了安石榴苷存在主動轉(zhuǎn)運的方式。pH為6.0時安石榴苷AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運多于pH為7.4時，酸性條件促進安石榴苷的吸收，初步推測是由于酸性條件可促進安石榴苷的電離進而促進了其吸收。

P-gp是由人MDR1基因編碼的跨膜轉(zhuǎn)運糖蛋白，主要分布于細胞質(zhì)膜上[13]。P-糖蛋白可通過利用ATP水解所釋放的能量將底物排出細胞外，是主要的外排轉(zhuǎn)運蛋白。P-gp抑制劑存在的條件下，安石榴苷的Papp(AP-BL)值增大、Papp(BL-AP)值減小，維拉帕米與環(huán)孢菌素兩種代表性P-gp抑制劑均能促進安石榴苷在Caco-2細胞上的吸收、抑制其外排，P-糖蛋白參與了安石榴苷的轉(zhuǎn)運。

綜上可知，安石榴苷易于被Caco-2細胞吸收，在Caco-2細胞上的轉(zhuǎn)運方式以主動轉(zhuǎn)運為主，不具有濃度依賴性。同時安石榴苷在Caco-2細胞的吸收、轉(zhuǎn)運、外排均受濃度、溫度、pH值及P-gp抑制劑的影響，P-糖蛋白參與了安石榴苷的轉(zhuǎn)運。