觀賞海棠不同葉位色素組分動態(tài)研究

姜文龍，李千惠，周 婷，江 皓，張往祥

（南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.揚(yáng)州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225200）

高等植物葉片色素組分可分為花青素（Anth）、類胡蘿卜素（Car）和葉綠素（Chl），其中花青素顯粉色、紅色、紫色等，類胡蘿卜素顯紅色、黃色、橙色，葉綠素顯綠色[1]，而不同色素間比例關(guān)系的變化使植物葉片呈現(xiàn)不同色彩，如雞爪槭[2]、紫甘藍(lán)[3]、李屬彩葉植物[4]等。此為植物葉片呈色的直接原因[5]。

觀賞海棠Malusspp.是薔薇科Rosaceae蘋果屬M(fèi)alus落葉小喬木，因其花姿優(yōu)美，享有“國艷”之美譽(yù)而被廣泛關(guān)注，近年來雜交技術(shù)的進(jìn)步涌現(xiàn)出許多海棠優(yōu)良觀葉品種，然而這些品種尤其是紅葉品種，在新葉至成熟葉的生長過程中色彩易發(fā)生分化[6]，顯著影響了海棠的觀葉效果。

傳統(tǒng)的植物色素分析方法是將試材經(jīng)溶液提取后在分光光度計(jì)上進(jìn)行測定分析，該方法費(fèi)時費(fèi)力，且對試材破壞性較大。無損傷光學(xué)測定法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了溶液提取法的短板，該方法利用葉片對光的反射與吸收原理，將反射波段數(shù)值代入公式計(jì)算得到色素相對含量，并與溶液提取方法所得的絕對含量進(jìn)行函數(shù)擬合，具有快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，適合大樣本背景下的數(shù)據(jù)處理[7-8]，目前國際上常用的光譜分析儀有Unispec光譜分析儀和MSR-16多光譜輻射儀[9]，其中Unispec光譜分析儀廣泛應(yīng)用于植物色素的觀測[10-12]。本研究將溶液提取法與Unispec光譜分析儀相結(jié)合，對57個觀賞海棠品種的葉片進(jìn)行色素含量動態(tài)測定，分析了葉片從新葉至成熟葉生長過程中色素變化特征以及動態(tài)規(guī)律，為海棠優(yōu)良觀葉種質(zhì)的篩選以及葉色改良提供理論參考。

1 材料和方法

試驗(yàn)地位于江蘇省揚(yáng)州市仙女鎮(zhèn)（119°55′E，32°42′ N），屬北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年降水量1 000 mm，年均溫14.9 ℃，無霜期約為320 d，地勢平坦。試驗(yàn)地土壤質(zhì)地為沙壤土，深厚肥沃。57份觀賞海棠種質(zhì)為1年生嫁接苗，其砧木采用1年生湖北海棠，嫁接時間為2015年9月，具體品種見表1。

色素相對含量測定：2016年5月于晴天的7:00—8:00進(jìn)行樣本采集，供試品種按上位葉（Upper leaf）、中位葉（Middle leaf）、下位葉（Lower leaf），分別從新梢部位、苗干中部和苗干下部各采集5枚葉片。采用Unispec-SC 光譜分析儀（美國，PP Systems）進(jìn)行花青素（Anth）、類胡蘿卜素（Car）和葉綠素（Chl）的相對含量測定，每枚葉片選擇不同的6個點(diǎn)進(jìn)行觀測，每個品種的重復(fù)次數(shù)為30次，最后代入公式計(jì)算。公式為花青素（Anth）：R800（1/R550-1/R700）；類胡蘿卜素（Car）：R800（1/R520-1/R700）；葉綠素（Chl）：（R750-R445）/（R705-R445）[13-14]。

色素絕對含量的測定及擬合函數(shù)的構(gòu)建：于5月按葉片色彩由淺至深的原則，選取M.‘Eleyi’、M.mandshurica、M.‘Thunder Child’、M.‘Roudph’、M.‘Show Time’的上位葉；M.‘Addirondack’、M.‘Weeping Madonna’ 的下位葉等7個具有代表性的品種，每個品種各采集20枚葉片。首先利用Unispec-SC 光譜分析儀對Anth、Car、Chl進(jìn)行反射光譜值的測定，之后將每個品種的葉片分為3組，進(jìn)行色素絕對含量的測定。其中花青素的測定方法采用2%鹽酸甲醇溶液浸提法[15-16]；葉綠素和類胡蘿卜素采用丙酮乙醇等量混合溶液浸提法[17]。最后分別擬合3大色素所對應(yīng)的方程，并計(jì)算57個海棠品種不同葉位的色素實(shí)際含量。

數(shù)據(jù)處理：函數(shù)的擬合采用Excel 2010進(jìn)行，色素組分的三維動態(tài)圖采用Origin 9.0進(jìn)行，聚類分析圖采用SPSS 19.0和MEGA 4.0進(jìn)行繪制。3大色素權(quán)重計(jì)算方法為：色素/3種色素總量；色系分類采用RHS比色卡法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片色素絕對含量與相對含量的擬合函數(shù)

選取具有一定色彩梯度的7個品種參與方程的擬合（見表2）。其中垂枝麥當(dāng)娜的花青素絕對含量和類胡蘿卜絕對含量均為最低，而葉綠素絕對含量為最高。花青素絕對含量最高的為時光秀，類胡蘿卜素絕對含量最高的是寶貝，葉綠素絕對含量最低的是魯?shù)婪颉?/p>

表3、圖1是基于7個不同色素梯度的代表性品種建立的葉片色素絕對含量（y）與相對含量（x）間的函數(shù)關(guān)系式，分別為：花青素yAnth=0.522 1x2- 0.111 4x+0.013 3（R2=0.979 3）；類胡蘿卜素yCar=0.456 2x+0.072 6（R2=0.980 9）；葉綠素yChl=1.428 7x-0.672 6（R2=0.901 6）。3種色素擬合效果較好，適用于57個海棠種質(zhì)的色素實(shí)際含量計(jì)算。

表2 花青素、類胡蘿卜素、葉綠素絕對含量和相對含量Table2 Absolute and relative contents of Anthocyanin, Carotenoid and Chlorophyll

表3 海棠葉片色素絕對含量與相對含量的擬合函數(shù)Table3 Fitting functions between absolute and relative contents of pigments in leaves of Begonia crabapple

2.2 不同葉位葉片色素含量的空間變化格局

基于57份觀賞海棠種質(zhì)的上、中、下位葉的色素含量（Anth、Car、Chl）分別繪制了不同葉位色素組分含量與權(quán)重的空間變化圖（圖2）。

圖1 3種色素絕對含量與相對含量的擬合函數(shù)Fig.1 Fitting function of absolute and relative contents of three pigments

圖2 觀賞海棠不同葉位色素組分含量與權(quán)重空間變化Fig.2 Spatial variations of pigment content and weight in different leaf positions of ornamental crabapple cultivars sea otters

在Anth、Car維度方面，隨著葉位的降低，57個海棠種質(zhì)的色素位點(diǎn)呈現(xiàn)出整體左移（減?。┑内厔?。Anth的權(quán)重（上位葉0.311% ～7.483%→中位葉0.277% ～ 3.332%→下位葉0.199% ～ 0.983%）與Car的權(quán)重（上位葉8.782% ～19.995%→中位葉6.464% ～ 13.557%→下位葉5.138% ～ 11.079%）相比下降幅度較大。

在Chl維度方面，隨著葉位的降低，海棠種質(zhì)的色素位點(diǎn)呈現(xiàn)出整體上移（增大）的趨勢，權(quán)重變化為：上位葉74.287% ～ 90.738%→中位葉 83.742% ～ 92.821% →下位葉 88.225% ～94.649%。

葉綠素在3大色素中所占比重最高，而花青素與類胡蘿卜素的比重呈較低水平。由此可見，葉綠素奠定了海棠葉片色彩的基調(diào)，花青素與類胡蘿卜素含量的高低使葉片呈現(xiàn)出不同的色彩。

2.3 基于觀賞海棠色素組分聚類分析

花青素含量的高低影響著葉片呈色，上位葉中花青素含量最高，因此基于上位葉葉綠素含量、花青素含量及權(quán)重數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析（圖3）。將葉片色彩與英國皇家園林比色卡比對后，結(jié)果表明：57份海棠種質(zhì)可分為綠色系（含深綠色系、褐綠色系）和紅色系含（紫紅色系、紅棕色系），各色系差異顯著（表4）。

圖3 基于上位葉色素組分含量和權(quán)重的聚類Fig.3 Clustering analysis tree diagram based on pigment component content and proportion in leaf positionsat upper leaf

表4 基于聚類分析的海棠品種色素參數(shù)統(tǒng)計(jì)與分析?Table4 Statistical analysis on parameters of ornamental crabapple’s leaf pigment based on clustering analysis

綠色系 A：隨著葉位的降低，花青素、類胡蘿卜素含量始終保持較低水平，而葉綠素含量穩(wěn)步增高（圖4），花青素/葉綠素為0.006 ± 0.003，因此葉片呈現(xiàn)綠色。該色系共28個品種，包含A1和A2兩個子類。

深綠色系A(chǔ)1（Green group）： 從上位葉至下位葉，花青素、類胡蘿卜素含量變化平穩(wěn)（差異不顯著），葉綠素含量分別增加了27%、75%，同時花青素與葉綠素之比達(dá)到全部色系最低，為0.004（圖4）。該色系共有18個品種，包括：M.‘David’、M.‘Donald Wyman’、M.‘Snowdrift’、M.‘Golden Raindrop’、M.‘Sugar Tyme’、M.‘Spring Snow’、M.‘Gorgeous’、M.‘Sweet Sugartyme’、M.‘Calocarpa’、M.‘Addirondack’、M.‘ Winter Red’ 、M.‘ G u a r d’ 、M.‘Everest’、M.‘Louisa’、M.‘Molten Lava’、M.‘Weeping Madonna’、M.‘Louisa Contort’、Xuanwu。

褐綠色系 A2（Yellow green group）：在上位葉中，花青素含量為綠色系最高（0.013 ±0.005）mg·g-1，較A1增加了51%，到中位葉階段淡化，與下位葉保持相同水平（圖4）。該色系共10個品種，包括：M.floribunda、Changhong、M.kirghisorum、M.‘Eleyi’、M.‘Professor Sprenger’、M.‘Hydrangea’、Nanjing Sanye、M.‘Mary Potter’、M.‘Ballet’、M.spectabilis。

紅色系（B）：上位葉具備一定量的花青素使該系呈現(xiàn)紅色（0.074 ± 0.027）mg·g-1，但隨后逐步下降，與上位葉相比，在中位葉和下位葉分別下降了50%、84%（圖4）。該色系共有29個品種，包含B1和B2兩個子類。

紫紅色系 B1（Purple group）：在上位葉中花青素含量以及花青素與葉綠素含量之比均為全部色系最高，其中花青素含量(0.078±0.025) mg·g-1是B2色系的2.1倍，花青素與葉綠素含量之比為0.04±0.013（圖4），因此該系呈色最紅。與上位葉相比，中位葉和下位葉分別下降了50%、85%，與紅色系整體變化基本相同。該色系共26個品種，包括：M.‘Centurion’、M.‘R e d B a r o n’、M.‘M a k a m i k’、M.‘Pink Spires’、M.‘Lisa’、M.‘Royal Raindrop’、M.‘Candy Mint’、M.‘Selkirk’、M.‘Purple Gems’、M.‘Purple Prince’、M.‘Brandy Wine’、M.‘Robinson’、M.‘Pink Princess’、M.‘Royalty’、M.‘Indian Summer’、M.‘Superstar’、M.‘Roudph’、M.‘Radiant’、M.‘Show Time’、M.‘Diamond’、M.‘Cardinal’、M.‘Coccinella’、M.‘Almey’、M.‘Adams’、M.‘Perfect Purple’、M.‘Thunder Child’。

圖4 不同色系類群的色素組分含量動態(tài)格局Fig.4 Dynamic pattern of pigment component content in leaves of different color series and subseries groups in different leaf positions

紅棕色系 B2（Red purple group）：上位葉的花青素含量較B1下降了53%（圖4），呈色不如B1醒目。該色系共3個品種，包括：M.‘Strawberry Jelly’、M.hupehensis、M.mandshurica。

3 結(jié)論與討論

3.1 觀賞海棠葉片色素含量與葉色關(guān)系討論

色素降解是植物葉片生長過程中較為普遍的現(xiàn)象，例如紅寶石海棠[18]、紅花檵木[19]、紫葉李[20]、金葉榆[21]等。

傳統(tǒng)海棠觀葉品種局限于原種，包括垂絲海棠M.halliana、西府海棠M.micromalus、湖北海棠M.hupehensis等，這些品種如湖北海棠，在本研究中屬B2紅棕色系，該系雖顯紅色但色彩不夠艷麗，同時在葉片生長過程中色素淡化較為嚴(yán)重，從上位葉至中位葉花青素含量減少了58.4%，與下位葉花青素含量 [（0.012±0.005）mg·g-1]幾乎持平（差異不顯著），因此呈色效果較差。近年來雜交技術(shù)的進(jìn)步豐富并提高了海棠葉色的多樣性和穩(wěn)定性，本研究中紅色系之紫紅色系（B1）品種皆為雜交種，該色系的花青素含量與B2相比不僅增加了53%，而且從上位葉至中位葉，花青素含量均值分別是B2子色系的2.1倍和2.6倍。此外，該色系在中位葉階段的花青素含量[（0.039±0.112）mg·g-1]雖較上位葉下降了50%，但仍然達(dá)到了B2色系在上位葉階段的含量水平[（0.037±0.017）mg·g-1]，因此該系葉色不僅“紅艷”，且呈色較為穩(wěn)定。

植物葉片中色素含量及其比例關(guān)系是葉色變化的主要原因之一，陳延惠等[22]在對園藝植物葉色變化機(jī)制的研究中指出葉色變化與花青素/葉綠素總量呈正相關(guān)關(guān)系，與葉綠素總量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。L*（亮度值）、C*（飽和度）、h°（色調(diào)角）是色彩三屬性[23]，其中h°能夠直觀地看出色彩的變化。根據(jù)姜文龍等[6]對觀賞海棠葉色的研究，紫紅色系的色調(diào)角（h°=33.98±10.29）較低位于深紅區(qū)域，具有“正紅”特性，在本研究中該色系（B1）的花青素含量以及花青素與葉綠素含量的比值均達(dá)到了全部色系最高，分別為0.078±0.025 mg·g-1、0.04±0.013，這為紫紅色系海棠品種的“正紅”特性提供了生理學(xué)解釋。由此可見，雜交育種對于觀賞海棠葉色的改良主要通過增加花青素含量，降低色調(diào)角來實(shí)現(xiàn)的。

3.2 觀賞海棠葉色穩(wěn)定性的保持及改良策略

花青素常與不同類型的糖苷相結(jié)合，以花色苷的形式存在于植物中的類黃酮化合物，是植物花、葉、果呈色的重要物質(zhì)之一[24]。花青素的合成與降解因素可分為外因和內(nèi)因，內(nèi)因包括結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[25-26]，外因包括光照[27]、溫度[28-29]、水分[30]、施肥元素配比[31]等。

近年來對于觀賞海棠葉片花青素的調(diào)控多集中于內(nèi)外環(huán)境因子誘導(dǎo)方面。高燕[32]采用低氮脅迫處理海棠花Malus spectabilis離體葉片，發(fā)現(xiàn)隨著氮濃度的降低，離體葉片中的花青苷含量呈增加趨勢。低溫可以促進(jìn)CHS基因的表達(dá)，使植物葉片花青素含量上升而葉綠素含量下降[33]，例如紅寶石海棠[18]、春雪海棠、王族海棠[34]。在本研究中，綠色系之褐綠色系（A2）在上位葉階段雖含有一定量的花青素，但不足以使葉片呈現(xiàn)出“全紅”狀態(tài)，因此綠色表達(dá)效果不如A1子色系，對于該系的改良應(yīng)減少花青素，使葉片呈現(xiàn)出“純綠”狀態(tài)；紅色系之紫紅色系（B1）在上位葉階段具有最多的花青素，中位葉階段雖有所淡化，但其含量仍達(dá)到了B2子色系在上位葉階段的水平，具有較大的改良潛力。該系在成熟葉階段色素淡化較為嚴(yán)重，其含量較新葉（上位葉）已下降了85%，因此對于紫紅色系的改良應(yīng)通過低氮脅迫、低溫誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)光照等方法來減緩葉片生長過程中色素的淡化，使整株葉片達(dá)到“全紅”效果。

本研究以57個觀賞海棠品種的葉片色素為基礎(chǔ)，研究了不同葉位階段3大色素（Anth、Car、Chl）含量的動態(tài)變化，為觀賞海棠葉片呈色提供理論依據(jù)。但本研究僅從宏觀角度對色彩與色素的關(guān)系進(jìn)行探討，未深入研究色素的形成機(jī)制，以及各色素間含量變化對于葉片呈色的影響。因此在今后的研究中，應(yīng)從基因、分子等微觀角度切入，對呈色機(jī)制作詳細(xì)探討，這對于觀賞海棠葉色育種及良種選育將有十分重要的意義。