不同運動方式對肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α/FNDC5/ PPARγ信號通路的影響

鄧 紅，徐曉陽，張 衛(wèi)

（1．華南師范大學 體育科學學院，廣東 廣州510631；2．廣州體育職業(yè)技術學院，廣東 廣州510650）

過氧化物酶體增殖物激活受體 γ輔助活化因子-1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）是與機體能量代謝關系較為密切的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，主要表達于富含線粒體的組織中，如骨骼肌、棕色脂肪、肝臟等。它與運動引起的一系列適應性變化，如線粒體生物發(fā)生、肌纖維類型轉(zhuǎn)化、能量代謝、血管生成等密切相關（Chinsomboon et al.,2013; Handschin et al.,2008b;Narkar et al.,2011; Stine et al.,2009），是運動防治代謝性疾病的主要靶點之一（Baar et al.,2002; Yan,2009）。已有研究表明，長期有氧運動和急性運動都可以增加骨骼肌 PGC-1α 的表達（Norheim et al.,2014;Ropelle et al.,2009）。鳶尾素（Irisin）（Bostrom et al.,2012）是 PGC-1α依賴性肌肉因子，Handschin（2007a）研究發(fā)現(xiàn)，運動首先誘導骨骼肌表達 PGC-1α，PGC-1α進而促進 FNDC5的表達，F(xiàn)NDC5被蛋白酶切生成一種新的形式——Irisin，Irisin從骨骼肌合成分泌后，進入血液循環(huán)作用于白色脂肪細胞，使其轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣炯毎瑥亩l(fā)揮減肥作用。多項研究指出，Irisin可以解釋運動引起的適應性變化，是運動減肥及防治代謝性疾病的新靶點（Kelly et al.,2012; Timmons et al.,2012;Villarroya,2012）。而 PPARγ是調(diào)控糖脂代謝的重要核受體，是FNDC5信號通路的下游靶蛋白之一，在機體肥胖中發(fā)揮著重要的作用（Guan et al.,2002）。

目前，長期有氧運動提升高脂膳食小鼠以及大鼠骨骼肌中的 PGC-1α，繼而促進脂肪酸的有氧氧化已被眾多研究證實（蘇坤霞,2019; Yuan et al.,2014）。并且有研究認為，有氧運動引起大鼠骨骼肌 PGC-1α的變化跟運動強度關系密切（許杰 等,2018）。隨著運動增進健康的研究深入，抗阻運動的控體重以及減脂效果也被越來越多的人認可（高艷敏 等,2017），但是抗阻運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合對肥胖大鼠骨骼肌 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信號通路的調(diào)控尚不清楚。本研究通過高脂膳食誘導造成大鼠肥胖模型，并進行抗阻運動、有氧運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合干預，觀察不同運動方式對肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α、FNDC5以及 PPARγ轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的影響，進一步探討 PGC-1α、FNDC5以及 PPARγ在多種運動方式相結(jié)合中降體重和減脂的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SD雄性健康大鼠，由中山醫(yī)科大學動物研究中心提供。分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由攝食和飲水。

1.2 主要儀器設備與試劑

實時熒光定量 PCR儀（BIO-RAD）、微量分光光度計K2800（北京凱奧科技有限公司）、垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（BIO-RAD）。此外提取組織RNA及PCR的相關試劑均購自TAKARA公司。

主要抗體包括抗 PGC-1α（CST）、FNDC5（CST）、PPARγ（CST）、β-actin抗體（杭州賢至），以及羊抗兔IgG-HRP（博士德），羊抗小鼠 IgG-HRP（博士德）等。PVDF膜（BIO RAD），蛋白提取液（碧云天生物）。

1.3 實驗分組與肥胖造模

大鼠適應性喂養(yǎng) 1周后，隨機分為正常對照組（CON組，8只，喂普通飼料）和肥胖造模組（60只，喂高脂飼料）（朱惠蓮 等,2002），所有飼料混勻后加適量水壓成條狀，烘干即成。每天定時記錄大鼠的體重、攝食量和飲水量，喂養(yǎng)12周后挑選體重超過正常組大鼠10%的大鼠作為造模成功大鼠（陳佳紅 等,2006; Wood et al.,2003）。從造模成功大鼠中隨機選取32只分為肥胖對照組（OC組）、肥胖有氧運動組（OAE組）、肥胖抗阻運動組（ORE組）、肥胖抗阻運動+有氧運動組（OARE組），每組 8只，喂普通飼料，進行后續(xù)實驗方案。

1.4 運動方案

有氧運動組：采用 BCPT-98型動物跑臺，坡度為 0，跑臺速度0～100 m/min可任意調(diào)節(jié)，運動采用循序漸進的方式，適應性運動 1周，然后逐漸增加運動時間和運動速度，最大運動速度定于20 m/min，運動30 min休息1 min，共運動60 min，隔天運動，共運動12周。

抗阻運動組：大鼠抗阻運動采用尾部負重爬梯的方式（Lee et al.,2004），負重的重量以大鼠體重的20%為起點，每周以大鼠體重 20%的重量遞增，根據(jù)大鼠的實際情況，大鼠最終的負重總量為大鼠體重的100%。每次運動6組，每組爬梯6次，組間休息30 s，爬完3組休息2 min，再進行另外3組運動，隔天運動，共運動12周。

抗阻運動+有氧運動組：抗阻運動和有氧運動交替進行，具體運動強度和運動時間跟單一運動一樣。

1.5 取材

在第 12周末次運動后 24 h左右進行采樣，采樣前對所有大鼠禁食過夜。腹腔注射水合氯醛（10%）麻醉實驗大鼠，腹主動脈取血，迅速剝離腓腸肌、腎周脂肪墊和附睪脂肪墊等待測組織并稱重，迅速放入液氮罐速凍，然后將樣品轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 大鼠體脂率的計算

體脂率=（左右腎周脂肪+左右附睪脂肪）/體重×100%（朱小烽 等,2017）45。

1.7 腓腸肌PGC-1α、FNDC5及PPARγ mRNA表達量的測定

采用Trizol 提取腓腸肌總RNA，測量總RNA的濃度。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應后合成 cDNA，實時熒光定量 PCR 法測定PGC-1α、FNDC5及 PPARγ的 mRNA 表達量。以 β-actin為內(nèi)參，RQmin、Rqmax及Ct值由軟件自動分析得出，采用 2-△△Ct進行相關定量。利用 NCBIPrimer-BLAST功能設計相關引物，實驗所需引物序列見表1。

表1 基因上下游引物序列Table 1 Primer Sequences of Target Genes

1.8 腓腸肌PGC-1α、FNDC5及PPARγ蛋白的測定

將液氮中保存的大鼠腓腸肌組織于冰上加入 RIPA 裂解液研磨，提取組織蛋白，離心獲取上清后進行BCA法蛋白定量，將定量裂解后的樣品取 100 ul加入 5X蛋白上樣緩沖液25 ul混勻。煮沸處理15 min，冷卻后待用。電泳時總上樣量為 50 ug總蛋白。根據(jù)目的蛋白的分子量制膠，常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將膜完全浸沒于 5%的脫脂奶粉中，水平搖床室溫孵育2 h進行封閉。用5%BSA-TBST稀釋一抗（PGC-1α 1:1 500，F(xiàn)NDC5：1:500，PPARγ：1:500，內(nèi)參抗體 β-actin 1:1 000），4℃水平搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜5次后，加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h（1:2 500）。TBST洗膜5次后ECL顯影，膠片曝光。使用 ImageJ軟件分析各個條帶的灰度值，進行統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件數(shù)據(jù)包處理，各數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差（M±SD）表示。多組間比較采用 One-way ANOVA中的兩兩比較（LSD檢驗），顯著性水平均為P＜0.05，相關性分析采用雙變量相關性分析，以 P＜0.05和P＜0.01定為差異顯著性水平的界值。

2 研究結(jié)果

2.1 抗阻運動、有氧運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合對肥胖大鼠體重、體脂率的影響

表 2的結(jié)果顯示，大鼠造模前組間沒有顯著性差異，造模成功后，肥胖各組大鼠體重組間沒有差異，但都顯著高于正常對照組組（P＜0.05），并且造模組大鼠的體重高于對照組10%以上；經(jīng)過12周的運動干預后，肥胖抗阻運動組、肥胖有氧運動組、肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠的體重都顯著低于肥胖對照組（P＜0.05），并且肥胖有氧運動組和肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠的體重顯著低于肥胖抗阻運動組（P＜0.05）；肥胖有氧運動組大鼠的體脂率顯著低于肥胖對照組（P＜0.05），肥胖抗阻運動組以及肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠的體脂率低于肥胖對照組，高于肥胖有氧運動組，但都沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 不同運動方式對肥胖大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白表達量的影響

圖 1的結(jié)果顯示，正常對照組、肥胖有氧運動組、肥胖抗阻運動組以及肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白表達量都顯著高于肥胖對照組（P＜0.05）；肥胖有氧運動組大鼠骨骼肌 PGC-1α的mRNA和蛋白表達量顯著高于肥胖抗阻運動組和肥胖抗阻運動+有氧運動組（P＜0.05），肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白表達量顯著高于肥胖抗阻運動組（P＜0.05）。

圖1 不同組大鼠骨骼肌PGC-1α的mRNA和蛋白的相對表達量比較Figure 1. Comparisons of Relative Expression Levels of PGC-1α mRNA and Protein in Skeletal Muscle of Different Groups

表2 不同組大鼠體重、體脂率的比較Table 2 Comparisons of Body Weight and Body Fat Percentage among Different Groups

2.3 不同運動方式對肥胖大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白表達量的影響

如圖2所示，正常對照組、肥胖有氧運動組、肥胖抗阻運動組以及肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白的表達量都顯著高于肥胖對照組（P＜0.05）；肥胖有氧運動組大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白的表達量顯著高于肥胖抗阻運動組和肥胖抗阻運動+有氧運動組（P＜0.05）。肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白的表達量顯著高于肥胖抗阻運動組（P＜0.05）。

圖2 不同組大鼠骨骼肌FNDC5的mRNA和蛋白表達量的比較Figure 2. Comparisons of Relative Expression Levels of FNDC5 mRNA and Protein in Skeletal Muscle of Different Groups注：n=8，“*”表示與正常對照組組相比，P＜0.05；“#”表示與OC組相比，P＜0.05；“▲”表示與 OAE組相比，P＜0.05；“&”表示與ORE組相比，P＜0.05。

2.4 不同運動方式對肥胖大鼠骨骼肌PPARγ的mRNA和蛋白表達量的影響

如圖3所示，正常對照組、肥胖有氧運動組、肥胖抗阻運動組以及肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠骨骼肌 PPARγ的mRNA和蛋白的表達量都顯著高于肥胖對照組（P＜0.05）；肥胖有氧運動組大鼠骨骼肌 PPARγ的 mRNA和蛋白的表達量顯著高于肥胖抗阻運動組和肥胖抗阻運動+有氧運動組（P＜0.05），肥胖抗阻運動+有氧運動組大鼠骨骼肌PPARγ的mRNA和蛋白的表達量顯著高于肥胖抗阻運動組（P＜0.05）。

圖3 不同組大鼠骨骼肌PPARγ的mRNA和蛋白表達量的比較Figure 3. Comparisons of Relative Expression Levels of PPARγ mRNA and Protein in Skeletal Muscle of Different Groups注：n=8，“*”表示與正常對照組組相比，P＜0.05；“#”表示與 OC組相比，P＜0.05；“▲”表示與 OAE組相比，P＜0.05；“&”表示與ORE組相比，P＜0.05。

2.5 PGC-1α、PPARγ及 FNDC5基因及蛋白表達量與大鼠體重、體脂重量、體脂百分比的相關性分析

表 3的結(jié)果顯示，大鼠骨骼肌 PGC-1α、FNDC5及PPARγ的mRNA及蛋白表達量與大鼠體重、體脂重量、體脂百分比呈負相關，且都具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 PGC-1α、FNDC5及PPARγ的mRNA和蛋白表達量與大鼠體重、體脂重量、體脂百分比的相關性分析Table 3 The Correlation between mRNA and Protein Expression Levels of PGC-1α, FNDC5,and PPARγ with the Body Weight, Body Fat Weight and Body Fat Percentage

3 討論與分析

肥胖是嚴重危害人類健康的現(xiàn)代病癥，可導致眾多的并發(fā)癥，比如高血壓、高血脂、糖尿病和腫瘤等，如何防治肥胖已成為人們關注和研究的重點?，F(xiàn)今認為，將飲食控制、運動療法、行為療法三者有機結(jié)合起來是治療肥胖的較好方法。然而運動控制肥胖的機制，目前尚不完全清楚。

傳統(tǒng)的觀點認為，運動減肥宜采取中低強度、長時間的持續(xù)有氧運動鍛煉。但大多數(shù)肥胖人群由于體重過大，對長時間中低強度運動難以堅持，因此，從時間效益角度考慮，中低強度長時間持續(xù)運動的減肥方式效果欠佳。相關研究表明，一定負荷的抗阻力訓練可以改變身體脂肪組織和肌肉組織的平衡關系，增加人體肌肉的重量，而肌肉含量的增加會增加機體的基礎代謝率，從而達到減脂的目的（Kraemer et al.,1999; Schmitz et al.,2003; Shaw et al.,2006）。并且抗阻運動持續(xù)時間短、運動帶來的愉悅感強，對于肥胖患者來說，更容易接受和耐受（王京京,2013; Ohawara et al.,2007）。本研究發(fā)現(xiàn)，在減體重方面，抗阻運動和有氧運動，以及兩者相結(jié)合效果都比較明顯，其中效果最好的是抗阻運動與有氧運動相結(jié)合的方式。在降體脂率方面，雖然本研究所采用的單純抗阻運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合的減脂效果，沒有有氧運動效果好，但從時間效應上來說，這兩種運動方式所耗費的時間遠遠短于單純有氧運動的時間。結(jié)果提示，抗阻運動的減脂效果可能與運動強度等參數(shù)密切相關，后續(xù)應該對不同強度以及不同持續(xù)時間的抗阻運動與減脂的效益關系，進行進一步的研究。

PGC-1α是與機體能量代謝關系密切的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α缺乏可抑制棕色脂肪產(chǎn)熱相關基因表達（Uldry et al.,2006）。長期有氧運動和急性運動都可以增加骨骼肌PGC-1α的表達（朱小烽 等,2017; Norheim et al.,2014; Ropelle et al.,2009; Yuan et al.,2014）。我們的研究也證實了這一現(xiàn)象。與正常對照組相比，肥胖組大鼠骨骼肌 PGC-1α的 mRNA和蛋白的表達都顯著低于正常對照組大鼠，而經(jīng)過 12周的運動干預后，肥胖有氧運動組 PGC-1α的 mRNA和蛋白的表達量顯著高于肥胖對照組，并且PGC-1α的 mRNA與蛋白表達量與大鼠的體重、體脂重量、體脂百分比呈非常顯著負相關。

雖然已有研究證實，抗阻訓練同耐力運動一樣，具有促進機體能量代謝的積極效應，但抗阻訓練對于 PGC-1α機制是否也同樣有效，目前研究報道比較少，而且關于抗阻運動與有氧運動相結(jié)合對PGC-1α的影響，尚未見報道。李鵬飛等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，8周的爬梯負重訓練后大鼠趾長伸肌 PGC-1α表達顯著增加，而比目魚肌 PGC-1α表達則顯著降低，他們認為，抗阻訓練對比目魚肌和趾長伸肌產(chǎn)生的不同作用可能與快、慢肌纖維構(gòu)成有關。

運動可以引起骨骼肌PGC-1α表達增加，PGC-1α可以誘導 FNDC5表達升高，F(xiàn)NDC5是一種分泌性蛋白，在骨骼肌合成后經(jīng)蛋白酶剪切修飾產(chǎn)生一種新的激素 Irisin。該激素可作為骨骼肌與外周組織或器官之間的信使分子，作用于白色脂肪并上調(diào) UCP1的表達，促進皮下白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化（Bostrom et al.,2012），提高能量消耗，減輕體重，改善糖代謝，進而達到減肥的目的。很多學者（Roberts et al.,2013; Spiegelman et al.,2012; Zadegan et al.,2015）研究發(fā)現(xiàn)，Irisin依賴于 PGC-1α而發(fā)揮作用，不同運動可以促進高脂喂養(yǎng)肥胖鼠類血漿Irisin和肌肉FNDC5的 mRNA表達水平提升（Chen et al.,2015; Lu et al.,2016;Wrann et al.,2013）。

PPARγ是調(diào)控 UCP1等棕色脂肪基因表達的重要核受體，是FNDC5信號通路的下游靶蛋白之一，在脂肪代謝、能量平衡等中起到重要的調(diào)節(jié)作用（Guan et al.,2002; Rosen et al.,1999）。較多研究發(fā)現(xiàn)，運動可以誘導骨骼肌 PGC-1α的高表達，進而激活PPAR。朱小烽等（2017）48等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠骨骼肌PPARβ與PPARγ在中等強度運動與大強度運動后都有顯著性增加，但是在小強度運動后沒有顯著性變化，他們認為運動強度可能是導致這一現(xiàn)象的關鍵因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠骨骼肌 PGC-1α、FNDC5以及PPARγ的表達水平均有所下降，而抗阻運動、有氧運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合這 3種運動方式都能上調(diào)其表達，并且大鼠骨骼肌PGC-1α、FNDC5以及 PPARγ的表達量與大鼠的體重、體脂重量、體脂百分比呈非常顯著負相關。這些發(fā)現(xiàn)表明，抗阻運動、有氧運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合可以通過 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信號通路調(diào)節(jié)控制體重和減少體脂，其具體機制可能是由于高脂膳食降低了大鼠骨骼肌PGC-1α的含量，PGC-1α缺乏不僅可抑制棕色脂肪產(chǎn)熱相關基因表達，還會下調(diào)骨骼肌FNDC5的表達，導致進入血液的 Irisin含量降低，下游靶蛋白PPARγ的表達減少，最終導致UCP1等棕色脂肪基因表達的減少，減少了能量消耗，從而導致大鼠體重、體脂增加。而經(jīng)過 12周的抗阻運動、有氧運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合，刺激了骨骼肌PGC-1α表達增加，PGC-1α刺激骨骼肌分泌Irisin，Irisin進入血液促進白色脂肪轉(zhuǎn)化為棕色脂肪，提高了能量消耗，進而達到減肥的目的。并且我們的研究還發(fā)現(xiàn)，肥胖有氧運動組大鼠骨骼肌 PGC-1α、FNDC5、PPARγ的mRNA和蛋白的表達量顯著高于肥胖抗阻運動組和肥胖抗阻運動與有氧運動相結(jié)合組，肥胖抗阻運動與有氧運動相結(jié)合組骨骼肌PGC-1α、FNDC5、PPARγ的 mRNA和蛋白的表達量顯著高于肥胖抗阻運動組。這說明在調(diào)控 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信號通路方面，本研究所采用的幾種運動方式中，有氧運動的效果明顯好于抗阻運動以及抗阻運動和有氧運動相結(jié)合的方式，而有氧運動和抗阻運動相結(jié)合效果好于單純的抗阻運動，這可能與運動方式本身有關系，也可能與抗阻運動的運動強度有一定的關系。許杰等（2018）的研究已經(jīng)證實，肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α的表達與耐力運動的運動強度密切相關，而關于抗阻運動的運動強度等參數(shù)與 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信號通路的關系，還有待進一步探索。本研究在確定抗阻運動強度時，考慮到肥胖大鼠本身體重比較重，為了安全起見并根據(jù)大鼠的實際運動情況，最終采用遞增負荷抗阻運動，大鼠尾部最終負重的強度達到大鼠總體重的100%，與王靜等（2011）的研究大鼠負重達到 200%還有一定的差距。但本研究所使用的抗阻運動，時間跟有氧運動相比時間明顯縮短，對運動減肥及防治代謝性疾病的相關靶點PGC-1α、FNDC5、PPARγ的 mRNA 和蛋白的影響顯著，對大鼠的體重、體脂、體脂百分比等肥胖相關指標的影響也比較顯著，減肥效果明顯。

4 小結(jié)

1．抗阻運動、有氧運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合，雖然運動方式不同，但均能上調(diào)肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α、FNDC5、PPARγ的 mRNA 和蛋白的表達量，促進白色脂肪“棕色化”，進而達到減脂的目的。

2．本研究所采用的抗阻運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合方式對肥胖大鼠骨骼肌 PGC-1α/FNDC5/PPARγ信號通路的上調(diào)程度及減脂效果，雖然沒有有氧運動效果好，但從時間效益上，抗阻運動以及抗阻運動與有氧運動相結(jié)合方式所用時間短，效果也相當明顯，運動強度等參數(shù)可能是導致這一現(xiàn)象的關鍵因素。