段 然
(北京大學國際醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 102206)
腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[1]。手術(shù)是治療腦膠質(zhì)瘤的常用方法,然而由于腦膠質(zhì)瘤惡性化程度較高、侵襲和浸潤能力較強,手術(shù)很難切除所有病灶。雖然放、化療可以有效控制腫瘤的生長,然而由于腦部解剖位置特殊,且有血腦屏障阻礙藥物向腦部的分布,因此其療效較差,患者生存期較短[2-3]?,F(xiàn)代研究表明姜黃中的有效成分姜黃素具有良好的抗腫瘤作用,對結(jié)腸、肝臟、乳腺等多種腫瘤具有良好的抑制和殺傷作用[4]。本研究探討姜黃素對人腦膠質(zhì)腫瘤細胞的體外抑制作用以及其可能的作用機制,以期為新型抑制劑的研發(fā)提供參考。
姜黃素購自北京金路鴻生物技術(shù)有限公司,使用無水二甲基亞砜(DMSO)溶解,并配制成100mM儲備液,貯存于-20°C條件下。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清購Biochrom公司,XTT試劑{c;3,3'-[1-(苯氨?;?3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉和吩嗪二甲酯硫酸鹽}、碘化丙啶以及PPAR-γ抑制劑GW9662購自Sigma公司。RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購自浙江浙科儀器設備有限公司。PPAR-γ和基因PCR引物[5]為上游:5'-CTTGGGTCGGCCTCGAG-3',下游:5'-CATTACGGAGAGATCCACGGA-3';GADPH基因引物為上游:GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG,下游:ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。引物由上海生工合成。
膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞株購自ATCC。培養(yǎng)基的選擇、傳代方法和時間以及培養(yǎng)條件根據(jù)按照ATCC網(wǎng)頁中的描述進行。培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱溫度37°C,二氧化碳含量5%。使用0.25%胰酶-EDTA對細胞進行解離。
腫瘤細胞于實驗前一天種植于96孔板中,每孔5 000個(2.5×104個/mL,200μL),在37°C,二氧化碳含量5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)基。對照組和觀察組細胞分別培養(yǎng)于含有DMSO(0.1%)不同濃度姜黃素,以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養(yǎng)基中(含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素),分別培養(yǎng)24h、48h和72h。培養(yǎng)結(jié)束后,向各孔中加入XTT試劑,試劑用量以及反應時間按說明書選擇。培養(yǎng)約2h后,在450和650nm波長下測定每孔的吸光度A450和A650。細胞活力按照以下公式計算。
細胞活力(%)=處理組A450-處理組A650/(對照組A450-對照組A650)×100%
U251腫瘤細胞于實驗前1天種植于24孔板中,每孔300 000個(0.5 x 106個/mL,600μL),培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液。對照組和觀察組細胞分別培養(yǎng)于含有DMSO(0.1%)不同濃度姜黃素,以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養(yǎng)基中(含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素),培養(yǎng)24h、48h和72h。培養(yǎng)結(jié)束后,細胞使用0.25%胰酶-EDTA解離,400g條件下離心10min,收集沉淀物。細胞沉淀用70%乙醇(-20°C)固定,并加入PI染色30min。染色結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液清洗2次,并將細胞重懸于300μL磷酸鹽緩沖液中,并使用流式細胞儀進行檢測。處于不同細胞周期的細胞含量計算由Flowjo完成。
U251腫瘤細胞于實驗前1天種植于24孔板中,每孔300 000個(0.5 x 106個/mL, 600μL),培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液。對照組和觀察組細胞分別培養(yǎng)于含有DMSO(0.1%)不同濃度姜黃素,以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養(yǎng)基中(含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素),培養(yǎng)8h。培養(yǎng)結(jié)束后細胞用0.25%胰酶-EDTA解離,并用PBS清洗一次。隨后使用Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。最后加入引物,并使用rt-qPCR對PPAR-γ基因表達進行定量。操作按照試劑盒的說明進行。
數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 進行整理,并用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理分析。計量資料以(±s)表示,實驗數(shù)據(jù)來源于至少3次獨立重復試驗。多個樣本的比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行,并用Tukey檢驗比較各組間差異的顯著性,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
不同濃度姜黃素對U251細胞活力的影響見表1至表3。結(jié)果表明姜黃素對U251細胞活力的影響呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。同時,檢測了PPAR-γ抑制劑GW9662對U251細胞活力的影響,結(jié)果表明GW9662本身對于U251細胞的活力沒有影響,給藥24、48和72h后U251細胞的活力與對照組相似,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。然而,GW9662 可以顯著減弱姜黃素對U251細胞的抑制能力,接受兩種藥物共同處理的細胞活力較單獨使用姜黃素組明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表1 姜黃素和GW9662培養(yǎng)24h對U251細胞活力的影響 (%,±s)
表1 姜黃素和GW9662培養(yǎng)24h對U251細胞活力的影響 (%,±s)
分組 細胞活力 t(與對照組比較)P(與對照組比較)對照組 100.0 0± 0.00姜黃素 1μM 94.04 ± 1.94 3.05 0.373姜黃素 3μM 91.96 ± 1.67 4.12 0.119姜黃素 10μM 87.50 ± 2.60 6.41 0.007姜黃素 30μM 72.64 ± 1.53 14.03 <0.001 GW9662 10μM 97.03 ± 0.60 1.52 0.925姜黃素 30μM + GW9662 10μM 83.98 ± 3.26 8.21 <0.001
表2 姜黃素和GW9662培養(yǎng)48h對U251細胞活力的影響 (%,±s)
表2 姜黃素和GW9662培養(yǎng)48h對U251細胞活力的影響 (%,±s)
P(與對照組比較)對照組 100.00±0.00姜黃素 1μM 91.11±2.67 4.27 0.100姜黃素 3μM 89.67±2.83 4.96 0.042姜黃素 10μM 80.85±1.94 9.20 <0.001姜黃素 30μM 41.74±2.42 29.87 <0.001 GW9662 10μM 97.86±1.21 1.03 0.988姜黃素 30μM + GW9662 10μM 75.92±0.64 11.570 <0.001分組 細胞活力 t(與對照組比較)
表3 姜黃素和GW9662培養(yǎng)72h對U251細胞活力的影響 (%,±s)
表3 姜黃素和GW9662培養(yǎng)72h對U251細胞活力的影響 (%,±s)
P(與對照組比較)對照組 100.0±0.00姜黃素 1μM 93.27±2.31 3.15 0.339姜黃素 3μM 84.62±2.92 7.21 0.003姜黃素 10μM 74.03±2.04 12.17 <0.001姜黃素 30μM 46.14±2.15 25.24 <0.001 GW9662 10μM 98.32±1.37 0.78 0.997姜黃素 30μM + GW9662 10μM 63.60±2.71 17.06 <0.001分組 細胞活力 t(與對照組比較)
姜黃素引起的細胞凋亡和細胞周期分布見表4至表6。結(jié)果表明姜黃素可以誘導Sub-G0期細胞的相對含量,且其誘導細胞凋亡的作用呈現(xiàn)時間依賴性。分析細胞周期的分布后,姜黃素主要引起細胞G0/G1期細胞周期阻滯,且作用呈現(xiàn)時間依賴性。在藥物作用的24~72h內(nèi),PPAR-γ抑制劑GW9662對U251細胞Sub-G0期的含量以及G0/G1期分布沒有明顯影響,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GW9662可以顯著降低姜黃素對U251細胞凋亡的誘導,明顯減少位于Sub-G0期細胞的含量(P<0.05)。同時GW9662可以逆轉(zhuǎn)姜黃素引起的G0/G1期細胞周期阻滯,明顯降低G0/G1期細胞的含量,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表4 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)24h對U251細胞周期的影響 (%,±s)
表4 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)24h對U251細胞周期的影響 (%,±s)
注:與對照組比較,△P<0.05。
分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對照組 7.19 ± 1.45 34.21 ± 1.54 26.92 ± 3.75 34.33 ± 2.41姜黃素 30μM 25.03 ± 2.62△ 53.73 ± 1.06△ 9.75 ± 2.31△ 38.52 ± 2.23 GW9662 10μM 6.43 ± 1.38 34.37 ± 0.46 29.69 ± 1.28 36.52 ± 2.56姜黃素 30μM +GW9662 10μM14.04 ± 0.81△ 44.12 ± 1.76△ 13.18 ± 0.91△ 35.68 ± 1.17
表5 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)48h對U251細胞周期的影響 (%,±s)
表5 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)48h對U251細胞周期的影響 (%,±s)
注:與對照組比較,△P<0.05。
分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對照組 4.72 ± 1.08 33.87 ± 1.35 30.9 ± 0.7 32.54 ± 2.08姜黃素 30μM 32.76 ± 2.85△45.73 ± 2.36△6.32 ± 2.63△ 19.61 ± 1.02 GW9662 10μM 7.24 ± 1.25 30.81 ± 1.88 31.57 ± 2.39 31.38 ± 1.58姜黃素 30μM +GW9662 10μM22.93 ± 0.83△42.89 ± 1.8△ 11.17 ± 0.79△35.38 ± 0.71
表6 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)72h對U251細胞周期的影響 (%,±s)
表6 姜黃素以及GW9662培養(yǎng)72h對U251細胞周期的影響 (%,±s)
注:與對照組比較,△P<0.05。
分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對照組 4.94 ± 1.46 35.85 ± 1.6 31.44 ± 3.56 37.88 ± 2.74姜黃素 30μM 40.08 ± 2.99△43.65 ± 1.23△9.22 ± 1.92△ 24.62 ± 1.20 GW9662 10μM 4.76 ± 0.17 35.66 ± 1.83 30.84 ± 1.09 36.19 ± 1.99姜黃素 30μM +GW9662 10μM22.78 ± 0.25△ 34.92 ± 1.31 12.96 ± 0.81△ 36.34 ± 1.19
姜黃素對PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響見表7。姜黃素可以提高PPAR-γ基因的表達,并呈現(xiàn)劑量依賴性。低劑量組(10μM)可以提高PPAR-γ基因的轉(zhuǎn)錄水平,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GW9662對PPAR-γ基因的轉(zhuǎn)錄不產(chǎn)生明顯影響,但可以顯著降低姜黃素引起的PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表7 姜黃素對PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響 (倍,±s)
表7 姜黃素對PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響 (倍,±s)
P(與對照組比較)對照組 1.00±0.00姜黃素 10μM 1.21±0.06 3.500 0.149姜黃素 30μM 1.40±0.08 6.667 0.002 GW9662 10μM 0.99±0.08 0.167 1.000姜黃素 30μM+GW9662 10μM 1.14±0.04 2.333 0.491分組t(與對照組比較)mRNA轉(zhuǎn)錄PPAR-γ/GADPH(倍數(shù))
過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)是一類配體激活型核受體,其活性與腫瘤細胞的生長、凋亡以及腫瘤細胞微環(huán)境的變化有密切聯(lián)系。體外研究表明,PPAR-γ受體在包括乳腺癌、肺癌、腸癌、肝癌以及腦膠質(zhì)細胞瘤的多種腫瘤細胞中均有表達[6-8];在U251腫瘤細胞中,由于miR-130b高表達等因素的作用,PPAR-γ呈現(xiàn)低表達狀態(tài);提高PPAR-γ的表達可以有效降低腫瘤的增殖和生長,加速腫瘤凋亡[9-10]。與提高其表達相似,通過藥物激活腫瘤細胞中的PPAR-γ受體也可以有效抑制細胞增殖、從而抑制腫瘤的生長和侵襲。具體機制包括以下幾類:激活PPAR-γ可以抑制細胞周期蛋白激酶Cdk4的活性,提高對Cdk4活性具有抑制作用的其他蛋白,例如p19、p21以及p27的表達,影響細胞的分裂過程[11];其次,激活PPAR-γ可以降低抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的含量,提高凋亡相關(guān)酶類Caspase-3 和 Caspase-7的活化,又到細胞凋亡[12]。此外,激活PPAR-γ可以降低COX-2、VEFG以及炎癥因子的表達,抑制腫瘤誘導的血管新生,并誘導細胞分化,從而抑制腫瘤的進展[13]。
姜黃素是莪術(shù)的主要有效成分之一,體外研究表明對多種腫瘤細胞有良好的抑制作用。研究結(jié)果表明,姜黃素的體外抗腫瘤作用與激活PPAR-γ有關(guān)。在姜黃素的作用下,U251細胞中PPAR-γ基因表達明顯提高;細胞周期分析表明大多數(shù)細胞位于sub-G0期以及G0/G1期,其形成原因可能與姜黃素誘導細胞凋亡以及抑制Cdk4活性有關(guān)。上述研究結(jié)果與已有的文獻報道一致。為了進一步證明其作用靶點位于PPAR-γ,用特異性抑制劑GW9662與姜黃素共同處理細胞,結(jié)果表明姜黃素對U251細胞的殺傷作用、誘導細胞凋亡的作用以及提高PPAR-γ表達的作用均明顯減弱。以上結(jié)果進一步確認PPAR-γ與姜黃素對U251細胞的生長抑制作用有關(guān)。值得注意的是,在GW9662存在的條件下,姜黃素依然具有一定的體外抗腫瘤活性,推測其抗腫瘤作用還可能還存在其他機制。根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)與ATP的相似性,推測其作用靶標可能還包括激酶等,需要進行進一步研究。
綜上所述,實驗結(jié)果表明姜黃素可以提高膠質(zhì)瘤U251細胞PPAR-γ的轉(zhuǎn)錄,誘導細胞凋亡以及G0/G1期細胞周期阻滯,其對腫瘤細胞生長的抑制作用于激活PPAR-γ有關(guān)。