納他霉素發(fā)酵液提取工藝研究

于少濱

摘? 要：本文對納他霉素發(fā)酵液的提取工藝進行研究。最佳提取工藝為提取溫度為25攝氏度，乙醇體積分數(shù)為75%，PH值10-11。檢測方法為流動相：甲醇-水-冰醋酸（55：40：5），檢測波長：302nm，流速：1.0m·min-1。柱溫：30℃。測定方法可用于納他霉素發(fā)酵液中納他霉素的含量測定。

關鍵詞：納他霉素發(fā)酵液;提取;研究

納他霉素為近白色或奶油黃色結晶粉末，納他霉素（Natamycin）是一種由鏈霉菌發(fā)酵產生的天然抗真菌化合物，屬于多烯大環(huán)內酯類。既可以廣泛有效的抑制各種霉菌、酵母菌的生長，又能抑制真菌毒素的產生，低劑量且安全性高的食品防腐劑[1-3]。納他霉素的作用機理是與真菌的麥角甾醇以及其他甾醇基團結合，使細胞膜畸變，最終導致滲漏，引起細胞死亡，對細菌沒有抑制作用。本文對納他霉素發(fā)酵液的提取工藝進行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HZY-404/503實驗室電子天平（浙江景程生物科技有限公司）;電熱恒溫水浴鍋-DU-30（杭州匯爾儀器設備有限公司）;0L-50L大型旋轉蒸發(fā)儀（北京賽美思儀器設備有限公司）;雙光束紫外可見分光光度計-UV1900（杭州匯爾儀器設備有限公司）;TGL20MW臺式大容量高速冷凍離心機（湖南赫西離心機儀器有限公司）;加熱磁力攪拌器（鄭州南北儀器設備有限公司）;MOLPW醫(yī)藥生物行業(yè)用超純水系統(tǒng)（上海摩勒科學儀器有限公司）;1UWB-6恒溫水浴箱（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）;SB-3200DTD上海凈信超聲波清洗機（衢州新芝生物科技有限公司）。

1.2 色譜柱

安捷倫 十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（218mm×4.6mm，5μm）。

1.3 對照品

納他霉素 購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4 試劑

甲醇（東營市鑫旺化工有限責任公司）、乙腈（東營市鑫旺化工有限責任公司）、冰醋酸（東營市鑫旺化工有限責任公司）。

2 提取工藝的研究

2.1 制備方法

將納他霉素發(fā)酵液調PH值10-12，經(jīng)75%乙醇提取后離心分離。

2.2 正交試驗

本實驗采用提取溫度、乙醇體積分數(shù)、PH值作為考察因素，采用正交試驗法對影響提取效率的其它工藝條件進行優(yōu)選。采用3個考察水平，用L9（34）正交表進行試驗，因素水平表見表1。

3 含量測定

3.1 流動相的選擇

分別考察甲醇-水-冰醋酸（68：30：2），甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）， 甲醇-乙腈-水-冰醋酸（30：20：50：0.1），甲醇-水-醋酸（50∶50∶1），水-甲醇-冰醋酸（50∶50∶0.02）不同比例的流動相，結果以甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）為流動相。

3.2 檢測波長的選擇

制備納他霉素對照品稀釋液照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010版一部 附錄Ⅴ A），于190～900nm波長范圍內進行全波長光譜掃描，記錄吸收光譜。在302nm處有最大吸收峰，故選用302nm為檢測波長。

依據(jù)查閱文獻及考查的結果，確定色譜條件如下[4-6]。流動相：甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）檢測波長：302nm，流速：1.0m·min-1。柱溫：30℃。理論板數(shù)按納他霉素峰計算應不得低于2000。

3.3 對照品溶液的制備

精密稱取在100℃減壓干燥至恒重的納他霉素對照品，加流動相制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

3.4 供試品溶液的制備

取納他霉素發(fā)酵液，加甲醇適量，超聲處理5分鐘，高速離心二十分鐘，過濾，放置至室溫，加流動相稀釋至100毫升，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

3.5 專屬性試驗

取納他霉素發(fā)酵輔料按樣品制備工藝制成陰性對照樣品，照3.4項下供試品溶液的制備方法制成陰性液，依上述方法測定，結果在納他霉素出峰處陰性液無色譜峰，結果陰性試驗沒有干擾，表明本方法專屬性良好。

3.6 對照品的線性考察

精密稱取100℃減壓干燥至恒重的納他霉素對照品50mg，置100ml容量瓶中，加入流動相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取1、2、3、4、5mL，置于10mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密上述溶液吸取10μL，注人液相色譜儀，依照3.2項下的色譜條件測定，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標，對照品進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果表明，納他霉素在50～250μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

4 討論

實驗結果表明提取溫度為25攝氏度，乙醇體積分數(shù)為75%，PH值10-11時納他霉素提取效果最好。測定方法可用于納他霉素發(fā)酵液中納他霉素的含量測定。新制備工藝使納他霉素的含量提高了為原來的1.2倍。

參考文獻

[1]李聽聽，陳偉，盧中一，李廣富.那他霉素復配防霉劑對儲藏小麥真菌多樣性和品質影響[J].中國糧油學報，2015（05）.

[2]魏杰，宋威，張國坤，張瀟.金褐霉素和納他霉素對冬棗品質及代謝相關酶的影響[J].食品科學技術學報，2015（05）.

[3]刁靜靜.肉類保藏技術（十二）生物防腐劑在肉品保鮮中的應用（一）——乳酸鏈球菌素和納他霉素[J].肉類研究，2009（03）.

[4]陳永艷，李彩瑞，楊秀敏，宋雙居，王志.高效液相色譜法測定果醬中的納他霉素[J].中國食品學報，2008（01）.

[5]Rapid ultraviolet spectrophotometric and liquid chromatographic methods for the determination of natamycin in lactoserum matrix. Capitán-Vallvey L F，Checa-Moreno R，Navas N，Capitán-Vallvey L F，Checa-Moreno R，Navas N. Journal of AOAC International. 2000.

[6]駱健美，金志華，岑沛霖.RP-HPLC法測定發(fā)酵液中納他霉素含量[J].中國抗生素雜志，2004（11）.