關(guān)于土壤及植被中真菌多樣性分析的意義及其方法

朱繼承 劉子超

一、意義：

1）真菌在自然界的作用：真菌的種類多，數(shù)量大，繁殖快，適應(yīng)性強，分布廣，與人類關(guān)系密切，是一類豐富的生物資源。真菌具有高度分解和合成多種復(fù)雜有機物質(zhì)的能力，特別對分解纖維素，半纖維素和木質(zhì)素等更具特色。因而在自然界，它們與細菌等共同協(xié)力，進行著緩慢而持續(xù)不斷的轉(zhuǎn)化作用，將動物、植物，特別是植物的殘體分解為簡單的物質(zhì)，重新歸還給大自然，成為綠色植物的養(yǎng)料，幫助植物界自我施肥，使綠色植物不斷地茂盛生長，間接地為人類提供必需的生活資源。同時，綠色植物光合作用所需要的二氧化碳，主要來自于有機物的分解，而植物光合作用所釋放的氧，又是人和動物所必需的。

2）真菌對近代工業(yè)的作用：真菌除了應(yīng)用于釀酒、制醬和其他發(fā)酵食品外，在近代工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等方面作用也很可觀。由于真菌能產(chǎn)生多種酶，它在工業(yè)方面發(fā)揮非同小可的作用，涉及到國民經(jīng)濟的各個領(lǐng)域，從甘油發(fā)酵，有機酸和酶制劑生產(chǎn)，到紡織、造紙、制革和石油發(fā)酵等等，均有方方面面的用處。例如，用其發(fā)酵作用，可以生產(chǎn)許多有機酸，其中最主要的有：檸檬酸、乳酸、葡萄糖酸等。這些有機酸在食品、化工、醫(yī)藥等方面都有很多用處。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)400多種酶與真菌有關(guān)?？墒敲腹I(yè)中，能真正利用真菌制成的酶制劑僅有十多種，這些制劑已廣泛應(yīng)用于食品、制藥、紡織和制革等部門。工業(yè)上采用重要的真菌酶類有淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、果膠酶、纖維素酶、脂肪酶和核糖核酸酶等。

3）真菌在農(nóng)林業(yè)中的作用：真菌在農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)，同樣發(fā)揮極大的作用，它除了供植物光合作用所需的二氧化碳外，有的真菌能與植物結(jié)成“菌根”，幫助植物吸收水分和養(yǎng)料;有的真菌則能消滅或抑制危害植物的其他生物，如昆蟲、線蟲和一些對植物有害的真菌等;有的能產(chǎn)生生長素和抗生素，以促進動物、植物的生長發(fā)育。

4）真菌在制藥業(yè)中的作用：早在本世紀40年代，人們就已經(jīng)認識真菌是藥業(yè)的好原料和助手

5）真菌引起的人類疾病：引起人類疾病的真菌只占真菌的一小部。據(jù)文獻報道，可使人致病的真菌約有278種。致病真菌分為兩大類，一類是病原性真菌，另一類是條件致病性真菌。后者平時不致病，在機體免疫力降低時才可致病。按真菌侵犯人體組織和器官的不同，又將真菌分為引起皮膚病的淺部真菌，引起深部組織器官疾病的深部真菌。寄生或腐生于角蛋白組織的表皮角質(zhì)層、毛發(fā)和甲板的真菌統(tǒng)稱為淺部真菌。它們引起的疾病統(tǒng)稱為淺部真菌病，簡稱為癬。目前已報道的皮膚癬菌有40多種，其中一部分僅感染動物，確認對人類致病的有20余種。上述的皮膚絲狀真菌分別屬于下面三個屬：即毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬。侵入表皮以外的真皮、粘膜和內(nèi)臟組織或器官的真菌，統(tǒng)稱為深部真菌。它們引起的疾病統(tǒng)稱為深部真菌病。隨著科學(xué)的發(fā)展和新技術(shù)向醫(yī)學(xué)的滲透，雖然臨床診斷技術(shù)和治療方法不斷更新和增多，然而深部真菌病亦有增多的趨勢。侵入深部器官引起深部真菌病的有隱球菌、念珠菌、球孢子菌、組織胞漿菌、孢子絲菌、著色真菌、鼻孢子菌、曲霉和毛霉等。它們雖然不像細菌或病毒那樣，普遍引起的疾病，但卻有地區(qū)流行特點，而且在人群中易發(fā)生隱性感染。

6）真菌引起的霉腐：在溫暖潮濕地區(qū)，有些真菌能引起糧食、飼料、食品、水果、蔬菜、肉類和蛋品等發(fā)霉變質(zhì)，不僅造成經(jīng)濟損失，而且會引起人畜中毒或其他損害，有些且能使實驗動物致癌。

二、研究現(xiàn)狀：

1）對于真菌的研究價值大多體現(xiàn)在藥用方面。雖然我國利用真菌作為藥物具有悠久的歷史，但真菌在藥物中所占比例很少，在我國近一萬種中藥材中，植物藥占絕對優(yōu)勢，其次為動物藥，傳統(tǒng)上沒有真菌藥，而是將真菌藥歸屬于植物藥。 所以，對于真菌多樣性分析，有利于發(fā)現(xiàn)新的菌株，更有利于對藥用菌的研究。

2）除藥用外，真菌在食用，養(yǎng)殖方面也有著很大的潛力，研究真菌多樣性有利于發(fā)現(xiàn)新的可食用菌。

三、步驟：

1、分離：取待測地區(qū)的土壤樣品若干克，帶回實驗室內(nèi)保存。制作PDA培養(yǎng)基若干，于培養(yǎng)基內(nèi)滴加少量乳酸，以抑制細菌生長，備用。取5只三角燒瓶，每只放90ml蒸餾水，封住瓶口，同時取35只試管，每只試管放9ml蒸餾水，塞住口，和上述三角燒瓶一同放入高溫高壓滅菌鍋中進行滅菌。完成后，取土壤5份，每份10克，于上述三角燒瓶中，震蕩均勻，取上清液1ml加入試管1中，震蕩均勻，再從試管1中取1ml加入試管2中，震蕩均勻，重復(fù)上述操作至試管7。此時試管1～7的菌的濃度分別為10-2，10-3～10-8。再從試管1中取少量液體，用涂布法接種于事先準備好的PDA培養(yǎng)基中，編號（編號時注意寫明制作日期及制作者姓名，以免混淆），放入25攝氏度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)日。

植被中真菌的分離（以竹子為例）：取目標地區(qū)的竹子少許，用酒精噴于表面，再用蒸餾水沖洗，以達到除菌的效果。在無菌操作臺下，用刀削去竹子表皮，取內(nèi)部新鮮部位少許，接種于PDA培養(yǎng)基中，分別編號，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、純化：培養(yǎng)數(shù)日后，將上述培養(yǎng)皿取出觀察，觀察菌的生長狀況，待其生長旺盛時取出。如果污染了細菌，則放棄該平板（細菌菌落為濕潤光滑狀，且生長速度普遍比真菌迅速）。放在顯微鏡下，觀察其無雜菌的部分，再挑出無雜菌的一小塊接種于新的培養(yǎng)基內(nèi)。如果是土壤中的真菌，可以將整個一小塊菌落全部挑出來。繼續(xù)放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察。

3、鑒定：待上述真菌生長旺盛后，放在顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)，并判斷其屬于何種菌。真菌的鑒定主要從其繁殖結(jié)構(gòu)上判斷。