天麻素在L6肌管中促進(jìn)葡萄糖消耗的作用和機(jī)制研究

張勇 孔維佳

[摘要] 目的 研究天麻素（GSTD）在L6肌管中促進(jìn)葡萄糖消耗的作用和可能機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)大鼠L6骨骼肌細(xì)胞并誘導(dǎo)分化成肌管，血清饑餓后以GSTD單獨(dú)處理或與濃度為0.05 nmol/L的胰島素聯(lián)合處理24 h，以二甲雙胍（Met）為陽性對(duì)照藥。部分實(shí)驗(yàn)中L6肌管先以濃度為100 nmol/L的胰島素處理24 h以誘導(dǎo)胰島素抵抗，再進(jìn)行藥物處理。以試劑盒測(cè)定細(xì)胞糖消耗、L-乳酸釋放和ATP產(chǎn)生，以Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)目標(biāo)蛋白和基因的表達(dá)水平。 結(jié)果 GSTD濃度依賴性地促進(jìn)L6肌管的基礎(chǔ)糖消耗[與對(duì)照細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）]，并且顯著增加胰島素刺激的糖消耗[與單用胰島素或GSTD處理的細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，濃度為500 μmol/L的GSTD仍能有效促進(jìn)細(xì)胞糖消耗（P < 0.05）。Met處理后顯著增加細(xì)胞的L-乳酸釋放并抑制ATP產(chǎn)生[與對(duì)照細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）]，但GSTD沒有作用。GSTD顯著上調(diào)L6肌管GLUT4蛋白和mRNA的表達(dá)，并且激活A(yù)MPK和Akt通路，表現(xiàn)為處理后p-AMPKα和p-Akt的水平顯著增加[與對(duì)照細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）]。 結(jié)論 GSTD作用于L6肌管顯著增加其糖消耗并能克服胰島素抵抗，其機(jī)制可能與GLUT4的上調(diào)以及AMPK和Akt通路的激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 天麻素;葡萄糖消耗;胰島素抵抗;糖酵解;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4;AMP依賴的蛋白激酶

[中圖分類號(hào)] R587.1;R284.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（a）-0022-04

[Abstract] Objective To investigate the activities and possible mechanisms of gastrodin （GSTD） to promote glucose consumption in L6 myotubes. Methods Rat L6 skeletal muscle cells were cultured in vitro and differentiated into myotubes. After serum starvation， GSTD was used to treat the myotubes for 24 h， either alone or in combination with insulin at a concentration of 0.05 nmol/L. Metformin （Met） was used a positive control drug. In some experiments， L6 myotubes were treated with 100 nmol/L of insulin for 24 h to induce insulin resistance before drug treatment. Commercial kits were used to determine cell glucose consumption， L-lactate release， and ATP production. The expression levels of target proteins and genes were determined by Western blot and real-time quantitative reverse transcription-PCR （RT-PCR）. Results GSTD promoted the basal glucose consumption of L6 myotubes in a concentration-dependent manner [comparing with control cells， the diferences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）]. In addition， GSTD greatly increased the insulin-stimulated glucose consumption [comparing with cells treated with insulin or GSTD alone， the diferences were statistically significant （P < 0.05）]. In a state of insulin resistance， GSTD at a concentration of 500 μmol/L was still effective to promote cell glucose consumption （P < 0.05）. After treatment， Met significantly increased cellular L-lactate release but decreased ATP production [comparing with control cells， the diferences were highly statistically significant （P < 0.01）]. However， GSTD did not have such effects. GSTD greatly up-regulated the protein and mRNA expression levels of GLUT4 in L6 myotubes. In addition， it activated the AMPK and Akt pathways， as indicated by the significant increase of p-AMPKα and p-Akt levels after treatment [comparing with control cells， the diferences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）]. Conclusion When used to treat L6 myotubes， GSTD greatly increases glucose consumption and is able to overcome insulin resistance. The mechanisms may be associated with the up-regulation of GLUT4 as well as the activation of AMPK and Akt pathways.

[Key words] Gastrodin; Glucose consumption; Insulin resistance; Glycolysis; Glucose transporter 4; AMP-activated protein kinase

天麻素（GSTD）是蘭科植物天麻的主要有效成分之一，具有多種藥理作用。有研究發(fā)現(xiàn)GSTD在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型中能有效降低空腹血糖[1]。筆者實(shí)驗(yàn)室的研究也發(fā)現(xiàn)，GSTD用于治療KK-Ay糖尿病小鼠能顯著降低空腹血糖，改善葡萄糖耐量并增加胰島素敏感性[2]。但目前GSTD在細(xì)胞水平對(duì)葡萄糖代謝的具體作用尚不明確，因此本文在體外培養(yǎng)的大鼠L6骨骼肌細(xì)胞中研究其對(duì)葡萄糖代謝的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

GSTD購自浙江誠意藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：20150812，純度≥98%）;二甲雙胍（Met）（PHR1084）和人胰島素溶液（I9278）購自美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基（11965092）和胎牛血清（FBS）（10100147）購自美國Gibco-Invitrogen公司。葡萄糖檢測(cè)試劑盒（己糖激酶法）（GL1611）購自英國Randox公司;L-乳酸測(cè)定試劑盒（E0139084）購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司;ATP含量測(cè)定試劑盒（A095）購自南京建成生物工程研究所。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）（#2213）、AMP依賴的蛋白激酶α（AMPKα）（#5832）、p-AMPKα（Thr172）（#2531）、Akt（#4691）、p-Akt（Ser473）（#4058）和β-肌動(dòng)蛋白（ACTB）（#4970）的鼠源或兔源單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。細(xì)胞RNA提?。↙S1040）、定量（E3310）、反轉(zhuǎn)錄（A3500）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（A6001）試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理? 大鼠L6骨骼肌細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基+10% FBS，于37℃、5%CO2的環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞傳代后生長至70%～80%融合時(shí)按文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道誘導(dǎo)分化直至出現(xiàn)肌管。L6肌管在無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓12 h然后進(jìn)行相應(yīng)處理，時(shí)間為24 h，所有處理組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 糖消耗測(cè)定? L6細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于96孔板，誘導(dǎo)分化并處理后收集培養(yǎng)液，以500 g離心5 min（半徑13.5 cm），收集上清液以試劑盒測(cè)定其中葡萄糖濃度并按照文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道的方法計(jì)算細(xì)胞糖消耗。對(duì)于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的糖消耗實(shí)驗(yàn)，L6肌管先以濃度為100 nmol/L的胰島素處理24 h以誘導(dǎo)胰島素抵抗[5]，再做相應(yīng)處理后測(cè)定細(xì)胞糖消耗，胰島素敏感的L6肌管同時(shí)處理作為對(duì)照。

1.2.3 L-乳酸和ATP測(cè)定? L6細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于12孔板，誘導(dǎo)分化并處理后收集培養(yǎng)液，以500 g離心5 min（半徑13.5 cm），收集上清液以試劑盒測(cè)定其中L-乳酸的濃度。同時(shí)收集細(xì)胞，勻漿后以試劑盒測(cè)定其中的ATP濃度，結(jié)果以樣品的蛋白含量進(jìn)行校正。

1.2.4 Western blot? L6細(xì)胞以1×106/孔的密度接種于6孔板，誘導(dǎo)分化并處理后按照文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法提取細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和Western blot檢測(cè)。按文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法對(duì)蛋白條帶進(jìn)行掃描和定量，以ACTB為內(nèi)參對(duì)GLUT4的表達(dá)水平進(jìn)行校正，以AMPKα或Akt為內(nèi)參對(duì)p-AMPKα和p-Akt的表達(dá)水平進(jìn)行校正。所有靶蛋白的表達(dá)水平均以對(duì)照細(xì)胞的倍數(shù)表示。

1.2.5 細(xì)胞RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR? L6細(xì)胞接種于6孔板，誘導(dǎo)分化并處理后以試劑盒提取細(xì)胞總RNA，定量后取1 μg為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系和條件參考文獻(xiàn)[3]報(bào)道。以Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增，引物和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道。以ACTB為內(nèi)參校正，以比較循環(huán)閾值（Ct）法對(duì)GLUT4 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果以對(duì)照細(xì)胞的倍數(shù)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSTD顯著促進(jìn)L6肌管的糖消耗

如圖1A所示，GSTD處理后顯著促進(jìn)L6肌管的基礎(chǔ)糖消耗，其作用呈濃度依賴性。125 μmol/L的GSTD即可使細(xì)胞糖消耗產(chǎn)生有統(tǒng)計(jì)意義的增加[與對(duì)照細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）]，當(dāng)其濃度達(dá)到500 μmol/L時(shí)，可使糖消耗較對(duì)照細(xì)胞平均升高約47.4%（P < 0.01）。除了基礎(chǔ)糖消耗，GSTD作用于L6肌管還顯著增加胰島素刺激的糖消耗。如圖1B所示，濃度為0.05 nmol/L的胰島素與500 μmol/L的GSTD聯(lián)合處理后，細(xì)胞糖消耗較二者單獨(dú)處理增加更為明顯（P < 0.05）。濃度為5 mmol/L的陽性對(duì)照藥Met也顯著促進(jìn)L6肌管的基礎(chǔ)糖消耗和胰島素刺激的糖消耗，其作用與500 μmol/L的GSTD相當(dāng)。

與胰島素敏感細(xì)胞比較，濃度為100 nmol/L的胰島素處理后生理鹽水組細(xì)胞的基礎(chǔ)糖消耗出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)意義的減少（P < 0.05或P < 0.01），而且再以0.05 nmol/L的胰島素處理，細(xì)胞糖消耗不能增加，提示胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)誘導(dǎo)成功（圖1C）。濃度為500 μmol/L的GSTD和5 mmol/L的Met在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下也能增加L6肌管的糖消耗[與生理鹽水處理的胰島素抵抗細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）]，但藥效較同樣處理的胰島素敏感細(xì)胞弱（P < 0.05）。

A：L6肌管基礎(chǔ)糖消耗。與對(duì)照細(xì)胞比較，*P < 0.05，**P < 0.01。B：胰島素刺激的糖消耗。與對(duì)照細(xì)胞比較，**P < 0.01;與單用胰島素、GSTD或Met的細(xì)胞比較，#P < 0.05。C：胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的糖消耗。與生理鹽水處理的胰島素敏感細(xì)胞比較，**P < 0.01;與相同處理的胰島素敏感細(xì)胞比較，#P < 0.05，##P < 0.01;與生理鹽水處理的胰島素抵抗細(xì)胞比較，$P < 0.05。GSTD：天麻素;Met：二甲雙胍

2.2 GSTD不影響L6肌管的糖酵解

Met顯著增加L6肌管L-乳酸的釋放并抑制ATP產(chǎn)生[與對(duì)照細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）]。而各濃度的GSTD對(duì)L6肌管的L-乳酸（圖2A）和ATP（圖2B）的產(chǎn)生均沒有影響，提示其不影響細(xì)胞糖酵解。

2.3 GSTD顯著上調(diào)L6肌管GLUT4的表達(dá)并激活A(yù)MPK和Akt通路

GSTD處理后濃度依賴性地上調(diào)L6肌管GLUT4蛋白（圖3A）和mRNA（圖3B）的表達(dá)[與對(duì)照細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）]。GSTD還能激活L6肌管的AMPK和Akt信號(hào)通路，表現(xiàn)為p-AMPKα（Thr172）和p-Akt（Ser473）的水平顯著增加[與對(duì)照細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）]。濃度為5 mmol/L的Met上調(diào)GLUT4、激活A(yù)MPK和Akt的作用與500 μmol/L的GSTD相當(dāng)。

3 討論

本研究探討了GSTD在L6骨骼肌細(xì)胞中調(diào)控糖代謝的作用和初步機(jī)制，并首次報(bào)道了其促進(jìn)細(xì)胞糖消耗的作用和對(duì)GLUT4表達(dá)的上調(diào)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)GSTD增加細(xì)胞糖消耗的機(jī)制與Met不完全相同。Met能通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ來抑制葡萄糖的有氧氧化和ATP合成，從而促進(jìn)葡萄糖的無氧酵解和乳酸釋放，增加細(xì)胞糖消耗[4]。而GSTD對(duì)細(xì)胞糖酵解和ATP的產(chǎn)生沒有影響，提示其對(duì)細(xì)胞的線粒體功能不產(chǎn)生抑制作用。事實(shí)上，有研究發(fā)現(xiàn)GSTD在神經(jīng)細(xì)胞中能改善線粒體功能并增加線粒體膜電位[6]。

GSTD增加L6肌管糖消耗的作用與GLUT4的上調(diào)以及AMPK和Akt的激活有關(guān)。筆者實(shí)驗(yàn)室以前的研究發(fā)現(xiàn)GSTD作用于肝細(xì)胞能顯著激活A(yù)MPK[7]，另有研究發(fā)現(xiàn)GSTD作用于心肌細(xì)胞能激活A(yù)kt通路[8]，本研究結(jié)果與之相符。GLUT4是L6細(xì)胞中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體[9-10]，AMPK和Akt是調(diào)控糖代謝的關(guān)鍵激酶，激活后二者均能促進(jìn)GLUT4的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，從而刺激細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和消耗[11-14]。目前GSTD對(duì)L6肌管GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取的影響以及與AMPK和Akt信號(hào)通路的相關(guān)性尚屬未知，需進(jìn)行深入研究。

除了基礎(chǔ)糖消耗，GSTD還顯著增加胰島素刺激的糖消耗并且在胰島素抵抗的L6肌管中仍具有促進(jìn)糖代謝的活性，這些體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的胰島素增敏作用相符合[2，15]。GSTD增加胰島素敏感性和改善胰島素抵抗的分子機(jī)制尚不明確，有可能與其抑制同型半胱氨酸的作用[16]以及抗炎和抗氧化活性[7]有關(guān)。筆者實(shí)驗(yàn)室正就GSTD的胰島素增敏作用和對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果提示GSTD作用于L6骨骼肌細(xì)胞能顯著促進(jìn)基礎(chǔ)糖消耗和胰島素刺激的糖消耗，并且在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下仍然有效，其作用機(jī)制與糖酵解無關(guān)，但可能與GLUT4表達(dá)上調(diào)以及AMPK和Akt通路的激活有關(guān)。結(jié)合其在糖尿病動(dòng)物模型中的良好效果[1-2]，GSTD在將來有可能開發(fā)成為新型的口服降糖藥。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 韓磊，喬愛敏，劉青.天麻素的抗糖尿病作用實(shí)驗(yàn)[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，34（6）：682-686.

[2]? 張勇，武燕彬，孔維佳.天麻素在KK-Ay小鼠中抗糖尿病作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2018，34（7）：917-924.

[3]? Shan YQ，Ren G，Wang YX，et al. Berberine analogue IMB-Y53 improves glucose-lowering efficacy by averting cellular efflux especially P-glycoprotein efflux [J]. Metabolism，2013，62（3）：446-456.

[4]? Xu M，Xiao Y，Yin J，et al. Berberine promotes glucose consumption independently of AMP-activated protein kinase activation [J]. PLoS One，2014，9（7）：e103702.

[5]? Liu LZ，Cheung SC，Lan LL，et al. Berberine modulates insulin signaling transduction in insulin-resistant cells [J]. Mol Cell Endocrinol，2010，317（1/2）：148-153.

[6]? 蔣根靈，李慶林.天麻素通過下調(diào)ERK1/2-p38信號(hào)通路保護(hù)谷氨酸損傷的PC12細(xì)胞[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，32（3）：71-75.

[7]? Qu LL，Yu B，Li Z，et al. Gastrodin ameliorates oxidative stress and proinflammatory response in nonalcoholic fatty liver disease through the AMPK/Nrf2 pathway [J]. Phytother Res，2016，30（3）：402-411.

[8]? Yang P，Han Y，Gui L，et al. Gastrodin attenuation of the inflammatory response in H9c2 cardiomyocytes involves inhibition of NF-κB and MAPKs activation via the phosphatidylinositol 3-kinase signaling [J]. Biochem Pharmacol，2013，85（8）：1124-1133.

[9]? Richter EA，Hargreaves M. Exercise，GLUT4，and skeletal muscle glucose uptake [J]. Physiol Rev，2013，93（3）：993-1017.

[10]? Hajiaghaalipour F，Khalilpourfarshbafi M，Arya A. Modulation of glucose transporter protein by dietary flavonoids in type 2 diabetes mellitus [J]. Int J Biol Sci，2015，11（5）：508-524.

[11]? Day EA，F(xiàn)ord RJ，Steinberg GR. AMPK as a therapeutic target for treating metabolic diseases [J]. Trends Endocrinol Metab，2017，28（8）：545-560.

[12]? Lee JO，Lee SK，Kim JH，et al. Metformin regulates glucose transporter 4（GLUT4）translocation through AMP-activated protein kinase（AMPK）-mediated Cbl/CAP signaling in 3T3-L1 preadipocyte cells [J]. J Biol Chem，2012，287（53）：44121-44129.

[13]? Waldhart AN，Dykstra H，Peck AS，et al. Phosphorylation of TXNIP by AKT mediates acute influx of glucose in response to insulin [J]. Cell Rep，2017，19（10）：2005-2013.

[14]? Rowland AF，F(xiàn)azakerley DJ，James DE. Mapping insulin/GLUT4 circuitry [J]. Traffic，2011，12（6）：672-681.

[15]? Kim MJ，Yang HJ，Moon BR，et al. Gastrodia elata Blume rhizome aqueous extract improves arterial thrombosis，dyslipidemia，and insulin response in testosterone-deficient rats [J]. Evid Based Complement Alternat Med，2017， 2017：2848570.

[16]? 白永，范曉明，郭家智，等.天麻素對(duì)胰島素抵抗模型中CBS表達(dá)的影響[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（4）：6-9.

（收稿日期：2018-06-12? 本文編輯：張瑜杰）