桑葉對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)和組織病理學(xué)的影響

蔡 明，牟 蘭，劉建勇，王宗禮，黃必志

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，云南 昆明 650212；3. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032）

桑(Morus alba)是桑科桑屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)的中北部，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性[1-2]，栽培范圍廣泛，現(xiàn)已擴(kuò)展到東亞、東南亞、歐洲、非洲、美洲等世界大部分地區(qū)。中國(guó)“種桑養(yǎng)蠶”歷史悠久，傳統(tǒng)蠶絲業(yè)在很長(zhǎng)的一段歷史時(shí)期內(nèi)對(duì)中國(guó)絲綢之路的發(fā)展及在對(duì)外貿(mào)易中起著極其重要的作用，至19世紀(jì)80年代后期，絲綢居中國(guó)出口商品第一位。目前，中國(guó)已成為世界最大的蠶絲出口和生產(chǎn)國(guó)，貿(mào)易量占全球的80%。近幾年，隨著紡織新技術(shù)的改進(jìn)、各種紡織新材料的沖擊，世界絲綢市場(chǎng)的萎縮，導(dǎo)致蠶桑市場(chǎng)波動(dòng)較大，風(fēng)險(xiǎn)較高。傳統(tǒng)蠶絲業(yè)受到嚴(yán)重影響，中國(guó)家蠶養(yǎng)殖逐年減少，大量桑葉閑置或焚燒。據(jù)測(cè)算，蠶桑資源的利用率只有總生物量的1%～3%，蠶農(nóng)和桑農(nóng)利益受損。傳統(tǒng)的種桑養(yǎng)蠶模式亟需新的轉(zhuǎn)型和多樣化發(fā)展。有試驗(yàn)表明，桑葉粗蛋白含量較高(占干物質(zhì)的20%左右)，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，適口性較好，且富含多種脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素和適宜的生物活性物質(zhì)[3-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)南方的桑園面積占了全國(guó)的68.9%，加之中國(guó)連續(xù)多年“東桑西移”政策的實(shí)施，目前桑園主要分布在廣西、四川和云南等亞熱帶地區(qū)。這些桑資源如能加工飼用，不僅能避免因焚燒造成的污染，而且能夠有效緩解優(yōu)質(zhì)蛋白飼草資源冬春季短缺的局面，促進(jìn)中國(guó)畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，取得良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。因此，桑葉在畜禽飼料化開發(fā)利用方面具有極大的潛力。

目前已有一些桑葉應(yīng)用于水產(chǎn)、家禽和家畜養(yǎng)殖，并產(chǎn)生了良好效益的報(bào)道[7-8]。但桑葉除了富含多樣的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之外，還存在抗?fàn)I養(yǎng)因子和部分活性物質(zhì)等不利于動(dòng)物生產(chǎn)的因素，因此在飼喂過程中如不注意量的控制，有可能產(chǎn)生不利影響[9-10]。目前，對(duì)于桑葉的飼用安全性、抗?fàn)I養(yǎng)因子降解和飼料加工調(diào)制方面的系統(tǒng)研究還較少。

本研究采用SD大鼠(Sprague-Dawley rats)經(jīng)口灌胃桑葉受試物28 d，恢復(fù)14 d，觀察桑葉對(duì)大鼠血液生化、組織器官及其病理學(xué)指標(biāo)變化的影響，探討其劑量-反應(yīng)關(guān)系，判定桑葉最大未觀察到有害作用劑量(NOAEL)，以期為桑葉的飼用安全性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇年齡5～7周的體重150～220 g的SD大鼠60只，許可證號(hào)SCXK(滇)K2015-0002。雌雄各半，分開飼養(yǎng)?；\內(nèi)采用滅菌玉米芯墊料，每周更換兩次，籠具洗刷消毒。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。

日糧飼喂 SPF(specific pathogen free)級(jí)大鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2012-0019。試驗(yàn)過程中SD大鼠不限飲水，飲用水為凈化自來水。試驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循動(dòng)物福利政策和相關(guān)要求。

SD 大鼠適應(yīng)期為 7 d，灌胃期 28 d，恢復(fù)期 14 d。以單次灌胃最大藥量(桑葉最大可配制濃度與最大灌胃容積的乘積)為高劑量，向下減半設(shè)置為低劑量。將桑葉風(fēng)干并研磨成粉末狀，將其與蒸餾水和1%羧甲基纖維素鈉水溶液混合，共設(shè)置3個(gè)處理組 (T1，溶媒對(duì)照組；T2，1 g·kg-1；T3，2 g·kg-1)，每組20只SD鼠(雌雄各半，分開飼養(yǎng))，每日每組灌胃 1 次，持續(xù) 28 d，灌胃容積 20 mL·kg-1。

1.2 血液生化指標(biāo)和臟器系數(shù)測(cè)定

灌胃期結(jié)束，每組隨機(jī)選取約2/3大鼠進(jìn)行采血，用西門子DimensionEXL200全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其血液生化指標(biāo)，并解剖摘取心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、胸腺、脾臟、肺、睪丸(雄性)、附睪(雄性)、卵巢(雌性)、子宮(雌性)稱重，進(jìn)行臟器系數(shù)計(jì)算。剩余大鼠停止灌胃恢復(fù)14 d，恢復(fù)期結(jié)束對(duì)剩余SD大鼠進(jìn)行相同指標(biāo)測(cè)定。

1.3 組織病理學(xué)觀察

灌胃期結(jié)束，對(duì)T1溶媒對(duì)照組和T3高劑量組約2/3大鼠進(jìn)行解剖檢查，觀察組織器官有無明顯的病理變化。并摘取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、腸放在10%中性福爾馬林固定液固定1周。采用Leica EG1160包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋，Leica RM2255 切片，Leica ST5020 染色機(jī) + Leica CV5030蓋片機(jī)連機(jī)進(jìn)行HE染色蓋片，Leica DM2500顯微鏡配合圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片采集，觀察記錄其組織學(xué)變化?；謴?fù)期結(jié)束，對(duì)T1溶媒對(duì)照組和T3高劑量組剩余大鼠進(jìn)行同樣的病理觀察。如T3高劑量組檢測(cè)發(fā)現(xiàn)明顯組織臟器病變異常，則再對(duì)T2低劑量組進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用 SPSS 17.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件，One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，并標(biāo)注顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

灌胃期結(jié)束時(shí)，與T1溶媒對(duì)照組相比，T2低劑量組、T3高劑量組各項(xiàng)血液生化指標(biāo)均顯著差異(P＞0.05)(表1)?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)，各劑量組與T1溶媒對(duì)照組相比，T2、T3處理組僅有尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 出 現(xiàn)變化 (表 2)。T2低劑 量 組 BUN升高 (P= 0.002)，T3高劑量組 BUN 降低 (P= 0.026)，但該變化趨勢(shì)無劑量相關(guān)性且變化幅度較小，屬于正常的試驗(yàn)波動(dòng)。其余各指標(biāo)無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 桑葉對(duì)大鼠臟器系數(shù)變化的影響

灌胃期結(jié)束時(shí)，與T1溶媒對(duì)照組相比，T2低劑量組、T3高劑量組雌、雄性大鼠各器官臟器系數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)(表 3、表 4)?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)，與T1溶媒對(duì)照組相比，僅雌性大鼠的低劑量組肺系數(shù)、肝臟和脾臟系數(shù)降低(P＜0.05)(表5)。雄性大鼠各器官臟器系數(shù)與T1溶媒對(duì)照組相比均無顯著差異 (P＞0.05)(表 6)。

2.3 桑葉對(duì)大鼠主要臟器的病理學(xué)影響

2.3.1 循環(huán)系統(tǒng)

心臟(灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束)，T1溶媒對(duì)照組和T3高劑量組大鼠均未見明顯病理改變(圖1)。

2.3.2 呼吸系統(tǒng)

肺(灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束)，局部肺間質(zhì)增寬，肺組織內(nèi)部分肺泡壁增生，其內(nèi)可見不同程度的淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。

2.3.3 消化系統(tǒng)

胃(灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束)，T1溶媒對(duì)照組及T3高劑量組大鼠均未見明顯病理改變(圖3)。小腸(灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束)，小腸粘膜固有層內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)。肝臟(灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束)，肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死，中央靜脈周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。

2.3.4 泌尿系統(tǒng)

腎臟(灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束) ，間質(zhì)內(nèi)鈣化點(diǎn)(圖6)。

2.3.5 免疫系統(tǒng)

脾臟(灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束)，T1溶媒對(duì)照組和T3高劑量組大鼠均未見明顯病理改變(圖7)。

3 討論

隨著生產(chǎn)力的提高、社會(huì)的進(jìn)步和草牧業(yè)的快速發(fā)展，人們對(duì)肉奶蛋等畜禽產(chǎn)品的需求日益增加，食品安全意識(shí)日益增強(qiáng)[11-12]。而優(yōu)質(zhì)蛋白飼料短缺、冬春季青綠飼料不足是限制畜禽產(chǎn)品產(chǎn)出和威脅畜禽食品安全的重要因素[13]。桑葉營(yíng)養(yǎng)豐富，粗蛋白含量高，消化率高，氨基酸平衡，生長(zhǎng)季長(zhǎng)，具有開發(fā)成蛋白飼料源的重要潛力[14-16]。桑葉除富含營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有茉莉酸、花青素、黃酮類化合物、芪類化合物和萜類化合物等生物活性物質(zhì)[17-18]，具有抑菌、解熱、抗癌、抗氧化、降糖、降脂和改善代謝等積極作用[19-20]。但有研究表明，桑葉中的α-葡萄糖苷酶抑制劑，會(huì)引起動(dòng)物腹瀉等癥狀[21]。此外，桑葉中還存在單寧、植酸、氰化物等抗?fàn)I養(yǎng)因子，會(huì)造成部分動(dòng)物消 化障礙，影響營(yíng)養(yǎng)吸收，蛋白利用率低，且會(huì)對(duì)動(dòng)物生理造成一定的消極影響[22-24]。一般情況下，有機(jī)體接觸抗?fàn)I養(yǎng)因子的濃度越低，時(shí)間越短，損傷越輕，脫離后也越容易恢復(fù)。因此，本研究根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》(GB 15193.22-2014)《飼料毒理學(xué)評(píng)價(jià)-亞急性毒性試驗(yàn)》(GB/T 23179-2008)標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置了兩個(gè)時(shí)期(灌胃期和恢復(fù)期)。一方面以便長(zhǎng)期觀察桑葉受試物對(duì)SD大鼠臟器及組織系統(tǒng)深度的影響；另一方面如若造成不利影響，可觀察其機(jī)體恢復(fù)機(jī)能和毒性可逆性。

?

表 3 灌胃期桑葉對(duì)雌鼠臟器系數(shù)變化的影響Table 3 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of female SD rats at the end of the treatment period

表 4 灌胃期桑葉對(duì)雄鼠臟器系數(shù)變化的影響Table 4 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of male SD rats at the end of the treatment period

表 5 恢復(fù)期桑葉對(duì)雌鼠臟器系數(shù)變化的影響Table 5 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of female SD rats at the end of the recovery period

表 6 恢復(fù)期桑葉對(duì)雄鼠臟器系數(shù)變化的影響Table 6 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of male SD rats at the end of the recovery period

圖 1 無桑葉對(duì)照組 (T1)和 2 g·kg-1 桑葉處理組 (T3)的 SD 大鼠心肌病理顯微圖 (HE 10 ×)Figure 1 The pathology micrograph of the heart for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

圖 2 無桑葉對(duì)照組 (T1)和 2 g·kg-1 桑葉處理組 (T3)SD 大鼠肺病理顯微圖 (HE 10 ×) (HE 10 ×)Figure 2 The pathology micrograph of the lung for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

圖 3 無桑葉對(duì)照組 (T1)和 2 g·kg-1 桑葉處理組 (T3)的 SD 大鼠胃病理顯微圖 (HE 10 ×)Figure 3 The pathology micrograph of the stomach for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

圖 4 無桑葉對(duì)照組 (T1)和 2 g·kg-1 桑葉處理組 (T3)的 SD 大鼠小腸病理顯微圖 (HE 10 ×)Figure 4 The pathology micrograph of the small intestine for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

血液生化指標(biāo)廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究中， 當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到刺激或干擾其血液成分均可發(fā)生相應(yīng)變化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生病變，進(jìn)而能夠準(zhǔn)確反映動(dòng)物相關(guān)器官功能和機(jī)體健康狀況[25-27]。在灌胃期，各劑量組血液生化指標(biāo)無顯著差異(P＞0.05)。而在恢復(fù)期T2低劑量組、T3高劑量組僅有BUN產(chǎn)生變化。BUN不僅能體現(xiàn)蛋白在體內(nèi)的代謝利用情況而且是反映腎功能的重要指標(biāo)[28]。當(dāng)腎臟器官功能受損時(shí)，血液中的BUN會(huì)升高。本研究中，T2低劑量組增加而T3高劑量組減小，可見，變化趨勢(shì)無劑量相關(guān)性且變化幅度較小，屬正常的試驗(yàn)波動(dòng)。此外，血液學(xué)眾多指標(biāo)不是獨(dú)立的，是互相存在影響的，單一指標(biāo)數(shù)值的變動(dòng)缺少生物學(xué)意義。有研究表明，添加不同比例的發(fā)酵桑葉進(jìn)行肉牛飼喂試驗(yàn)，肉牛的血液生化指標(biāo)不受影響[29]。這與本研究結(jié)果基本一致。臟器質(zhì)量和系數(shù)的變化常能靈敏地反映中毒引起的病變狀況(器官增生、萎縮和充血等問題)，當(dāng)染毒后，動(dòng)物受損臟器重量會(huì)發(fā)生改變，能體現(xiàn)動(dòng)物基本的生物學(xué)特征[30]，據(jù)此，能估計(jì)出器官病變的性質(zhì)及發(fā)生程度。本研究中僅在恢復(fù)期時(shí)，T2低劑量組雌性大鼠的肺系數(shù)、肝臟和脾臟系數(shù)降低，其余均無顯著差異(P＞0.05)。這屬正常個(gè)體生理變化，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 5 無桑葉對(duì)照組 (T1)和 2 g·kg-1 桑葉處理組 (T3)的 SD 大鼠肝臟病理顯微圖 (HE 10 ×)Figure 5 The pathology micrograph of the liver for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

圖 6 無桑葉對(duì)照組 (T1)和 2 g·kg-1 桑葉處理組 (T3)的 SD 大鼠腎臟病理顯微圖 (HE 10 ×)Figure 6 The pathology micrograph of the renal for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

圖 7 無桑葉對(duì)照組 (T1)和 2 g·kg-1 桑葉處理組 (T3)的 SD 大鼠脾臟病理顯微圖 (HE 10 ×)Figure 7 The pathology micrograph of the spleen for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

動(dòng)物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)(心臟)、呼吸系統(tǒng)(肺)、消化系統(tǒng)(肝臟、胃、小腸)、泌尿系統(tǒng)(腎臟)、免疫系統(tǒng)(脾臟)等協(xié)調(diào)配合，使動(dòng)物內(nèi)各種復(fù)雜的生命活動(dòng)能夠正常持續(xù)進(jìn)行。本研究在灌胃期和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，大體解剖SD大鼠各組織系統(tǒng)器官用肉眼觀察其大小、顏色、質(zhì)地，均未見與桑葉受試物相關(guān)的異常改變。對(duì)T1溶媒對(duì)照組及T3高劑量組大鼠進(jìn)行組織病理學(xué)鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，病變主要發(fā)生在以下幾個(gè)系統(tǒng)的臟器：呼吸系統(tǒng)(肺)病變表現(xiàn)為局部肺間質(zhì)增寬，肺泡壁增生，其內(nèi)可見不同程度的淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。消化系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)病變的器官包括小腸、肝臟。小腸病變表現(xiàn)為粘膜固有層內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；肝臟病變表現(xiàn)為肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死。泌尿系統(tǒng)(腎臟)病變表現(xiàn)為間質(zhì)內(nèi)鈣化點(diǎn)。經(jīng)合并病例分析比較，以上病變?cè)赥1溶媒對(duì)照組與T3桑葉高劑量組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)上述各病變程度較輕，數(shù)量較少，這些病變情況可視為本研究各劑量組SD大鼠的自發(fā)病變，與受試物桑葉飼喂無關(guān)。此外，有研究表明，桑葚、桑枝等有助于修復(fù)小鼠的肝臟和腎臟器官損傷，對(duì)其具有保護(hù)功能[31-32]?？梢?，桑的正常飼喂對(duì)SD大鼠無有害影響，這可能由于單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子在桑葉中存在的量較低或者在SD大鼠消化過程中被降解造成的。但任何飼用植物的使用都應(yīng)在一個(gè)合理的閾值范圍內(nèi)，超出了這個(gè)范圍就不易發(fā)揮正面的作用甚至?xí)a(chǎn)生負(fù)作用。桑葉中具體哪種成分的安全性如何，還跟飼喂的動(dòng)物種類有關(guān)，關(guān)于其對(duì)動(dòng)物尤其是反芻動(dòng)物的精確飼喂閾值，還需結(jié)合具體的瘤胃微生物環(huán)境進(jìn)行全面評(píng)估和深入驗(yàn)證。

4 結(jié)論

我國(guó)桑園面積廣大，雖然具有量和質(zhì)的優(yōu)勢(shì)，但在飼用推廣之前，需檢驗(yàn)其安全性，進(jìn)行必要的毒性檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)，才能應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。本研究采用SD大鼠經(jīng)口灌胃給予桑葉28 d，恢復(fù)14 d，SD大鼠血液生化、臟器系數(shù)和組織病理學(xué)等指標(biāo)均未見與桑葉受試物相關(guān)的異常改變(P＞0.05)。本研究條件下，其無毒性反應(yīng)劑量(NOAEL)為2 g·kg-1桑葉，初步驗(yàn)證了桑葉的飼用安全性，為進(jìn)一步合理開發(fā)桑葉和毒理學(xué)研究提供了一定理論依據(jù)。未來在開發(fā)過程中需加強(qiáng)對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解研究，以提供進(jìn)一步的飼用安全開發(fā)參考。