牧草開花的分子機(jī)理研究進(jìn)展

王 娜，謝文剛

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

開花是植物重要的生長過程，適宜的開花時間可以使植物有效避免惡劣的自然環(huán)境，是成功進(jìn)行生殖生長的重要保證[1]。開花期是植物重要農(nóng)藝性狀，在牧草草產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、飼用品質(zhì)、混播草地利用價值等方面有舉足輕重的地位[2]。提前開花會限制牧草的營養(yǎng)生長，延遲開花則會限制種子的發(fā)育或使植株在遭遇惡劣天氣前已經(jīng)發(fā)生衰老[3]。牧草開花后飼草品質(zhì)呈快速下降趨勢，草牧業(yè)中可以基于不同生產(chǎn)需要，培育不同生育期的早、中、晚熟品種。早熟品種更適合種子生產(chǎn)，晚熟品種在混播草地中可以大幅度提高草地生產(chǎn)能力和利用效率，對推動草牧業(yè)發(fā)展具有深刻意義。

牧草開花時間的調(diào)控對于其生存繁殖及利用價值至關(guān)重要，受到自身發(fā)育規(guī)律和外部環(huán)境條件的雙重影響[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，模式植物擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、水稻 (Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)等一年生作物的開花分子機(jī)理及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，取得了重要成果。而牧草基本上是多年生、異花授粉植物，生產(chǎn)利用方式和作物具有明顯區(qū)別，但其開花分子機(jī)理研究較少。本文就植物開花分子機(jī)理研究最新成果進(jìn)行了綜述，以期為牧草開花基因挖掘、功能解析和分子機(jī)理研究提供參考，加快其分子育種進(jìn)程，提高育種水平和效率。

1 開花調(diào)控途徑

目前，通過擬南芥研究發(fā)現(xiàn)了多條開花調(diào)控途徑[5](光周期、春化作用、自主促進(jìn)和赤霉素途徑等)以及相關(guān)200多個預(yù)測基因[6]。光周期和春化與環(huán)境外源信號有關(guān)，通過光照、溫度調(diào)控植物花期。而自主促進(jìn)和赤霉素途徑與植物本身相關(guān)，是根據(jù)自身生長、發(fā)育和內(nèi)源性激素水平調(diào)節(jié)植物花期的[7]。光周期和自主促進(jìn)途徑在雙子葉和單子葉植物之間非常保守，但春化途徑出現(xiàn)較大差異，其關(guān)鍵在于啟動抑制物的性質(zhì)不同[擬南芥中的FLOWERING LOCUS C(FLC)和谷類中的VERNALIZATION2(VRN2)][8-9]。

1.1 光周期途徑

光周期途徑是指植物在感受到晝夜變化后，調(diào)控自身以促進(jìn)開花的過程[10]。根據(jù)光周期的不同，可以分為長日照和短日照開花植物[11]。多年生黑麥草(Lolium perenne)是短日照開花植物，而長日照開花植物則有擬南芥、小麥等。長日照(LDs)情況中，在光周期作用下擬南芥等提前開花，短日照(SDs)情況下光周期受到抑制，擬南芥開花延遲。但是Fernández等[12]發(fā)現(xiàn)在短日照條件下，擬南芥在CONSTANS(CO)相互作用下可以通過升高溫度使光周期更加敏感，進(jìn)而促進(jìn)開花。

在模式植物擬南芥屬中，CO基因在光受體和生物鐘的相互作用下特異性調(diào)控植物光周期途徑，表現(xiàn)出鮮明的動態(tài)變化，GIGANTEA(GI)基因同樣首先在擬南芥中鑒定，并且是被子植物中光周期開花的重要調(diào)節(jié)者。研究證明，CO是連接光信號與FT基因的樞紐。在光信號影響下，CO蛋白穩(wěn)定性遭到破壞后將光信號傳遞到成花信號樞紐FT等基因處。此外，CO基因表達(dá)也是植物開花時間與生物鐘之間的紐帶，生物鐘借助節(jié)律基因GI調(diào)節(jié)CO的表達(dá)，促進(jìn)花分生組織特性基因APETALA1(AP1)、LEAFY(LFY)和CAULIFLOWER(CAL)的表達(dá)，激活FT基因，調(diào)控植物開花進(jìn)程[13]。

禾本科植物GI功能已被證實，特別是短日照條件下開花的草本植物。在水稻中，OsGI通過控制OsCO(OsHd1)的表達(dá)來調(diào)控開花時間，使其在短日照條件下開花提前，在長日照條件下開花延遲[14]。在玉米(Zea mays)中，ZmGI1基因影響植株的發(fā)育并抑制長日照條件下的開花[15]。

在多年生黑麥草中，LpCO(與LpHD1相同)屬于鋅指蛋白，含有保守CCT結(jié)構(gòu)域，是光周期途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子[16]。LpCO的調(diào)節(jié)機(jī)制與擬南芥CO基因類似，轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出晝夜振蕩，在長日照條件下，誘導(dǎo)下游基因FT以促進(jìn)多年生黑麥草的開花。多年生黑麥草的LpGI基因，與單子葉植物、真核生物的GI基因結(jié)構(gòu)整體保守，與草甸羊茅(Festuca pratensis)的GI蛋白最為類似。Gagic等[17]推斷LpGI極有可能與擬南芥GI直系同源，并參與黑麥草光周期開花時間控制。

但是，研究人員還發(fā)現(xiàn)，對于溫帶豆科草本如地三葉(Trifolium subterraneum)，其日間長度和光質(zhì)量響應(yīng)的整合可能不受CO-like(COL)基因的調(diào)控[18]。

1.2 春化作用途徑

春化作用指植物經(jīng)過一段時間持續(xù)的低溫處理，從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化并開花的生理現(xiàn)象。小麥、大麥和其他溫帶牧草在春化反應(yīng)方面表現(xiàn)出廣泛的遺傳差異。根據(jù)牧草春化特點，可分為冬性、春性以及弱冬性3種類型[19]。其中冬性品種若未春化，植株則維持在營養(yǎng)生長階段，或營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化為生殖生長過程持續(xù)，致開花延遲。春性品種對低溫反應(yīng)遲鈍，弱冬性品種只需經(jīng)歷短暫的春化處理。上述差異體現(xiàn)了重要的農(nóng)藝價值，因為春性和冬性品種的最佳播種日期不同，適應(yīng)地區(qū)亦不同[20]。

表觀遺傳調(diào)控在春化途徑中扮演重要角色，主要通過對表觀遺傳信息即DNA序列以外的遺傳信息進(jìn)行調(diào)控，如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)控等。在擬南芥研究中，春化過程與Polycomb Group(PcG)介導(dǎo)的組蛋白甲基化有關(guān)。PcG是動植物發(fā)育過程中的表觀調(diào)控因子，包括Polycomb Repressive Complex 1(PRC1)和Polycomb Repressive Complex 2(PRC2)兩種復(fù)合物。PRC2復(fù)合體決定H3K27me3的形成，當(dāng)H3K27me3積累到一定程度時，染色質(zhì)表觀呈現(xiàn)抑制狀態(tài)，此時靶基因轉(zhuǎn)錄水平會顯著降低。因此春化發(fā)生后FLC表達(dá)水平降低，其主要原因是長時間低溫處理后FLC染色質(zhì)從轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)向轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變，且伴隨著H3K4me3、H3乙?；绒D(zhuǎn)錄激活標(biāo)記的去除和H3K27me3、H3K9me3等轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)記的積累?？梢?，春化對FLC等開花抑制因子的轉(zhuǎn)錄抑制受到PRC2復(fù)合物調(diào)控[21]。

FLC基因一般通過抑制FT和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)的表達(dá)來推延植株開花。因此，F(xiàn)LC基因表達(dá)的下調(diào)解除了對FT和SOC1基因表達(dá)的抑制作用，進(jìn)而加速了植物的開花進(jìn)程。

目前，發(fā)現(xiàn)麥類作物中春化作用途徑控制開花的基因主要有VRN1、VRN2、VRN3以及VRN4，他們通過各自的方式一起調(diào)控麥類作物開花[22]。VRN1、VRN2和VRN3之間相互作用形成一個反饋調(diào)節(jié)環(huán)(圖1)[23]。春化前，VRN2約束VRN1、VRN3的表達(dá)。春化進(jìn)行時，VRN1活性隨之上升，VRN2活性隨之下降，此時VRN2的表達(dá)受到VRN1的抑制。春化作用加劇時，VRN2對VRN1、VRN3的抑制作用完全消除，VRN1、VRN3的表達(dá)加速，到達(dá)誘導(dǎo)開花需求的臨界點[24]?？梢奦RN2對開花具有負(fù)調(diào)控作用，是開花抑制因子，所以麥類作物主要抑制VRN2基因的表達(dá)來促進(jìn)開花[25]。目前，VRN1、VRN2、VRN3基因均被克隆，VRN4基因僅存在D基因組(VRN-D4)中，且未被克隆。Kippes等[26]發(fā)現(xiàn)VRN-D4屬于春化途徑一部分，處于VRN1、VRN2和VRN3基因上游，是VRN1、VRN2和VRN3基因的反饋調(diào)節(jié)環(huán)的一部分。

1.3 自主促進(jìn)途徑

圖 1 冬小麥VRN1、VRN2和VRN3反饋調(diào)節(jié)環(huán)Figure 1 Winter wheat VRN1, VRN2 and VRN3 feedback regulator rings

自主促進(jìn)途徑與植物自身有關(guān)，是通過植物體內(nèi)自身特性調(diào)控開花的方法，主要通過抑制FLC來促進(jìn)開花[27]。目前該途徑發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子有FCA、CK2、PP2A-B’c、FLD和REF6等基因。依照編碼的蛋白可以劃分為RNA結(jié)合蛋白和染色質(zhì)重塑因子。其中RNA結(jié)合蛋白有FCA等基因，是以mRNA 水平來調(diào)節(jié)FLC基因的表達(dá)的；染色質(zhì)重塑因子包括FLD和REF6等基因，其編碼的蛋白對FLC染色質(zhì)進(jìn)行修飾。此外，還有CK2和PP2A-B’c介導(dǎo)FLC的翻譯進(jìn)而修飾調(diào)控開花[28]。總之，自主促進(jìn)與春化途徑一樣，通過控制FLC基因的表達(dá)來促進(jìn)開花，這使得春化作用途徑與自主促進(jìn)途徑通過FLC基因連接在一起[29]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子(TAF)識別基因的核心啟動子，是TFIID復(fù)合體中的一般轉(zhuǎn)錄因子。TAF15b在自主促進(jìn)途徑中通過上調(diào)FLC基因影響擬南芥開花時間[30]。

1.4 赤霉素途徑

赤霉素途徑主要依靠外源施加赤霉素替代春化作用促使植株開花。Yabuta和Hayasi[31]從赤霉菌培養(yǎng)基濾液分離出了一種致使水稻患惡苗病的物質(zhì)，同時發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對于植物節(jié)間生長具有促進(jìn)作用，因而命名該物質(zhì)為赤霉素（gibberellin acid,GA）。赤霉素是一種植物激素，合成于植物的芽、嫩葉等。其機(jī)理為刺激莖、葉的伸長生長，抑制塊莖形成，抑制側(cè)芽休眠，抑制衰老，提高生長素水平等[32]。赤霉素通過激發(fā)開花基因LFY的轉(zhuǎn)錄活性，刺激上調(diào)LFY和SOC1基因的表達(dá)，進(jìn)而啟動開花[33]。在Xue等[34]的研究中，編碼赤霉素2-β-雙加氧酶1的基因在水稻胚中高度表達(dá)，紅三葉(Trifolium pratense)的早花和中花階段，赤霉素2-β-雙加氧酶也高度表達(dá)。

2 開花途徑關(guān)系

開花途徑各自孤立，但又彼此聯(lián)系。研究表明，開花途徑在節(jié)點基因的調(diào)控下關(guān)聯(lián)在一起[35]。其中在擬南芥的開花研究中，發(fā)現(xiàn)開花途徑與內(nèi)源、環(huán)境信號相互作用，使這些信號向開花整合基因FT、LFY、SOC1、FLC和CO等基因聚合表達(dá)，共同調(diào)控開花進(jìn)程[36]。

FT基因位于不同開花途徑的交匯處，在植物開花調(diào)控中起關(guān)鍵作用[37]。聯(lián)合光周期、春化和自主途徑的信號，調(diào)控植物開花。LFY基因既調(diào)節(jié)花序向花分生組織轉(zhuǎn)變，又在光周期、春化、自主促進(jìn)和赤霉素途徑共同作用下控制開花時間[38]，是整合外部環(huán)境和內(nèi)源信息的重要開花控制因子[39]。SOC1是編碼MADS-box的轉(zhuǎn)錄因子，在花器官發(fā)育相一致的葉片和分生組織中表達(dá)[40]。在兩個SOC1啟動子處，由CO和FLC共同調(diào)控[41]。FLC通過擾亂啟動子的可及性來負(fù)調(diào)控SOC1，阻止開花，直到植物重新獲得開花能力[42]。SOC1的核心作用是與AP1的同源基因一起調(diào)控花序發(fā)育的LFY基因[43]。AP1和LFY是將花促進(jìn)基因連接到花結(jié)構(gòu)發(fā)育的兩個主要基因[44-45]。SOC1是各個途徑調(diào)節(jié)的交叉點。FLC基因與春化、自主途徑密切相關(guān)。在春化過程前，F(xiàn)LC抑制花發(fā)生，阻止頂端分生組織轉(zhuǎn)化為繁殖結(jié)構(gòu)所必需的生理變化[46]。在長時間暴露于寒冷之后，F(xiàn)LC被抑制，植物開始開花。Michaels和Amasino[47]認(rèn)為，自主促進(jìn)與春化途徑共同協(xié)作使得FLC基因受到抑制。CO基因編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其作用受生物鐘和光周期的成花素FT調(diào)控[48]。

3 牧草開花的分子機(jī)理

3.1 禾本科牧草開花基因研究

3.1.1 黑麥草開花基因研究

多年生黑麥草是世界溫帶地區(qū)普遍種植的優(yōu)質(zhì)牧草。Gagic等[17]研究發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草LpGI基因可能與擬南芥GI基因同源，參與黑麥草的光周期開花時間控制。Sk?t等[49]通過關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行候選基因表型的評估，證實LpHd1除對抽穗有促進(jìn)作用外，還與開花時間顯著關(guān)聯(lián)。Fiil等[50]分析多個多年生黑麥草開花控制基因，LpFT3基因的表達(dá)由生物鐘控制，與日照長度相關(guān)，與春化時間密切相關(guān)，過表達(dá)LpFT3促進(jìn)開花；LpTFL1與LpFT基因功能相反，抑制黑麥草的開花；LpCO編碼的蛋白長時間誘導(dǎo)LpFT的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)多年生黑麥草的開花；LpVRN1春化處理后開始表達(dá)，通過抑制VRN2的表達(dá)促進(jìn)植株開花。

Wang和Forster[51]通過比較基因組學(xué)方法鑒定了多年生黑麥草開花誘導(dǎo)途徑以及參與的關(guān)鍵基因(圖2、表1)。多年生黑麥草的開花時間通常以抽穗期(HD)來衡量，共鑒定了36個與抽穗期相關(guān)的QTL，QTL分布在7個連鎖群上。多年生黑麥草中鑒定的直系同源基因LpFT3，定位于LG7上，該基因的表達(dá)處于生物鐘控制之下，與日照長度、春化時間密切相關(guān)。第2個中央整合子，SOC1的表達(dá)受FT的調(diào)控以促進(jìn)發(fā)育，鑒定的SOC1的直系同源基因LpSOC1定位在LG6上。此外，發(fā)現(xiàn) MADS-box基因LpMADS1(與LpVRN1相同)和LpMADS2具有SOC1-like基因的功能。春化途徑中，LpVRN1是單子葉植物TmVRN1基因的假定直系同源基因，由春化誘導(dǎo)，位于多年生黑麥草的LG4上。3個含MADS-box結(jié)構(gòu)域的基因(LpMADS1、LpMADS2和LpMADS3)被春化處理上調(diào)，另一個含MADS-box的基因LpMADS10基于與LpMADS1的蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用而被確定，并被證明是通過春化處理下調(diào)的。LpMADS1與LG4上的LpVRN1基因座相同，LpMADS2、LpMADS3和LpMADS10的位置是未知的。光周期途徑中，LpCO基因定位在LG7上，與AtCO具有類似的組織結(jié)構(gòu)，2個外顯子和1個含鋅指結(jié)構(gòu)域的內(nèi)含子，啟動子區(qū)域的序列與水稻OsHD1和大麥HvCO的相應(yīng)區(qū)域也有很高的相似性。LpCOL1位于LG6上，與LG7上報道的其他兩個CO-like基因座不同。LpCOL1顯示具有與LpCO類似的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)模式，而不影響春化。LG3上的LpGI基因與其他單子葉植物和真核生物的GI基因具有高水平的結(jié)構(gòu)保守性，并表現(xiàn)出晝夜模式。LpGI的組 成型表達(dá)充分補充了擬南芥、gi-3、突變中的缺陷，證實了黑麥草基因的功能狀態(tài)。屬于自主途徑的FLD基因的同源基因也在LG2上被鑒定和定位，但基因功能尚未鑒定。

圖 2 多年生黑麥草開花調(diào)控示意圖Figure 2 Perennial ryegrass flowering control schematic diagram

3.1.2 鴨茅開花基因研究

鴨茅(Dactylis glomerata)是禾本科鴨茅屬的多年生牧草，在世界溫帶地區(qū)普遍分布和種植。近年來，鴨茅開花分子的探索得到了很好的開展。Xie 等[52]以晚熟和早熟鴨茅基因型為親本構(gòu)建了F2作圖群體，共檢測到7個影響開花性狀的QTL，分別位于第2、5、6組，解釋表型變異在7.85%～24.19%。基于水稻、小麥、黑麥草、高羊茅(Festuca elata)等物種的開花基因(如FT、Hd、VRN等)的保守序列設(shè)計基因探針，對鴨茅開花基因序列進(jìn)行捕獲，涉及引物在作圖群體里擴(kuò)增，最終在鴨茅第3號連鎖群上成功定位了VRN3基因[53]。Zhao 等[54]對鴨茅 F2群體的 214 個單株和親本進(jìn)行高通量測序，構(gòu)建了四倍體高密度遺傳連鎖圖譜，結(jié)合兩年三點的開花表型數(shù)據(jù)，定位了與開花相關(guān)的CO、FT及VRN1基因位點5個。Zhao 等[55]利用CONSTANS(DgCO1)，F(xiàn)LOWERING TIME(DgFT1)、a VRN1 like MADS-box(DgMADS)和PHOTOPERIOD(DgPPD1-like)共 4個開花候選基因在150個單株組成的關(guān)聯(lián)群體里進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)DgCO1基因與鴨茅開花顯著關(guān)聯(lián)。

Feng等[56]利用鴨茅不同時期花序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組，測序共鑒定了77個與開花相關(guān)的基因(圖3)。其中，有VRN1、VIN3和FRI等24個與春化有關(guān)的候選基因，TIC、COL和FD等20個與光周期途徑有關(guān)的候選基因，以及12個生物鐘候選基因、8個自主促進(jìn)候選基因、5個赤霉素候選基因、4個衰老候選基因和4個整合基因。光周期途徑相關(guān)基因在第2階段和第5階段富集，表明該途徑中的基因可能對不同長度的日照時間有反應(yīng)。此外，光合作用相關(guān)基因在春化期表現(xiàn)出強烈的階段依賴性和高表達(dá)水平，這可能表明這些基因是緊密共表達(dá)的。VRN1和FRI等大多數(shù)春化相關(guān)基因在第2階段和第5階段高水平表達(dá)。VRN1在第2階段的高水平表達(dá)符合低溫誘導(dǎo)VRN1。在擬南芥中，F(xiàn)RI是一個上游調(diào)控因子，通過激活FLC，抑制整合子FT的表達(dá)，從而導(dǎo)致晚開花。數(shù)據(jù)顯示，在第2階段期間FRI高表達(dá)，然后在第3階段期間急劇下降，表明春化導(dǎo)致FRI降解。FLC在春化階段表達(dá)量較低，隨后逐漸增加，直至抽穗 期。相反，F(xiàn)T在春化過程中表達(dá)量較高，而在其他時期表達(dá)量較低，這說明低溫抑制FLC表達(dá)和解除FT抑制導(dǎo)致開花。

表 1 多年生黑麥草開花途徑參與基因Table 1 Genes involved in flowering pathway of Perennial ryegrass

續(xù)表 1Table 1 (Continued)

3.1.3 羊茅屬牧草開花基因研究

陳錫等[57]通過RACE技術(shù)，用高羊茅“黔草1號”作為材料，克隆植物開花基因FT，命名為FaFT2。推斷FaFT2與高羊茅光周期具有一定的關(guān)聯(lián)性，過度表達(dá)可能導(dǎo)致植株提前開花(表2)。王小利等[58]根據(jù)多年生黑麥草VRN1基因序列設(shè)計的引物，用高羊茅莖基部組織的mRNA 為模板，進(jìn)行RT-PCR

圖 3 鴨茅開花調(diào)控示意圖Figure 3 Dactylis glomerata flowering control schematic diagram

分析。結(jié)合 3' RACE 和 5' RACE 法從高羊茅中擴(kuò)增出VRN1的全長cDNA 序列，命名為FaVRN1，發(fā)現(xiàn)該基因具有高度的保守性，是開花誘導(dǎo)基因。

表 2 牧草開花基因Table 2 Forage grass flowering gene

續(xù)表 2Table 2 (Continued)

在草甸羊茅(Festuca pratensis)研究中，Shinozuka等[59]評估了開花時間相關(guān)基因的核苷酸多樣性。對草甸羊茅VRN1、CO、FT1和CK2α直系同源基因FpVRN1、FpCO、FpFT1和FpCK2α進(jìn)行重新測序，并對3個樣本組內(nèi)的核苷酸多樣性進(jìn)行評估。證明FpVRN1誘導(dǎo)FT1基因表達(dá)，在春季促進(jìn)生殖器官的發(fā)育；FpCO聯(lián)合FT基因的啟動子以啟動表達(dá)；FpFT1誘導(dǎo)植株提前開花；FpCK2α在短日照條件下通過間接相互作用，增強CO-like蛋白質(zhì)的功能。

3.1.4 扁穗冰草開花基因研究

Zeng等[60]在扁穗冰草(Agropyron cristatum)研究中通過RNA-Seq和差異基因表達(dá)分析，研究開花發(fā)育的基因表達(dá)。對四倍體扁穗冰草的3個發(fā)育階段，即莖伸長期(VS)、孕穗期(BS)和開花期(AS)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析?？偣泊_定了113個開花時間相關(guān)基因，123個MADS-box基因和22個CONSTANSLike(COL)基因，其中發(fā)現(xiàn)ACOL作為CO候選基因，在葉片中特異性表達(dá)。產(chǎn)生一套新的基因組資源，用于鑒定和表征與扁穗冰草開花相關(guān)的基因和途徑。該發(fā)現(xiàn)不僅證明RNA-Seq和差異基因表達(dá)分析對無參考基因組物種的復(fù)雜性狀的相關(guān)基因的有效性，而且提高了我們對扁穗冰草光周期- 生物鐘-CO-FT的開花啟動調(diào)控途徑的認(rèn)識。

3.1.5 二穗短柄草開花基因研究

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)屬禾本科早熟禾亞科，由于其為一年生，生命周期短；株型小、易栽培；天然狀態(tài)下自花授粉；易遺傳轉(zhuǎn)化；具有豐富的遺傳變異材料。因此是研究麥類植物基因組學(xué)的優(yōu)良模式材料。Lomax等[61]在二穗短柄草中對減少春化需求的突變體進(jìn)行篩選時，鑒定出了隱性等位基因ENHANCER OF ZESTELIKE 1(EZL1)。EZL1是擬南芥CURLY LEAF 1的直系同源基因，是編碼PRC2的催化亞基。在EZL1突變體的轉(zhuǎn)錄組研究中，發(fā)現(xiàn)相比于無春化的野生型材料，EZL1-1中有近1 400個基因差異表達(dá)，并且約有800個基因在EZL1-1突變體中上調(diào)。其中前十個最高表達(dá)的基因中，有4個涉及開花：AGAMOUS(AG)、VRN1、SOC1和SEPALLATA 3(SEP3)。 當(dāng)AG、VRN1、SOC1和SEP3過度表達(dá)時，可能會促進(jìn)EZL1突變體表型快速開花。

3.2 豆科牧草開花基因研究

3.2.1 苜蓿屬牧草開花基因研究

Gao等[62]在紫花苜蓿(Medicago sativa)研究中表明，存在于植物分生組織中的SPL13在營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。通過SPL13過表達(dá)和SPL13基因沉默兩種紫花苜蓿植株進(jìn)行基因功能研究，過表達(dá)植株生長阻滯、枝條扭曲、葉片向上卷曲；沉默植株觀察到更多的側(cè)枝和開花時間延遲，表明SPL13參與枝梢發(fā)育的調(diào)控，過表達(dá)促進(jìn)開花。使用基于新一代測序技術(shù)的SPL13 RNAi植物的轉(zhuǎn)錄組分析來鑒定可能被SPL13直接靶向和下調(diào)的下游基因，將SPL13與MYB112基因聯(lián)系起來，表明MYB112受到SPL13的靶向和下調(diào)，基于下一代測序的轉(zhuǎn)錄組分析和染色質(zhì)免疫沉淀分析，表明MYB112可能參與調(diào)控苜蓿營養(yǎng)生長的過程。Aung等[63]研究表明，過度表達(dá)microRNA156(miR156)，紫花苜蓿表現(xiàn)出一種明顯的表型，節(jié)間長度縮短，開花時間延緩，纖維素含量增加，木質(zhì)素含量減少，生物量產(chǎn)量明顯提高。

在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)研究中，WOX家族成員STENOFOLIA(STF)在葉片的背面和正面交叉處的特定葉細(xì)胞中表達(dá)。Liu等[64]通過在六倍體小麥中表達(dá)M. truncatula STF，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植物明顯呈現(xiàn)葉片加寬，開花加速和葉綠素含量增加，表明STF參與植株葉片的擴(kuò)展。

3.2.2 三葉草屬開花基因研究

在紅三葉(Trifolium pratense)的研究中，Kovi等[65]選擇對具有弱結(jié)實率的‘Tripo'品種和具有強結(jié)實率的‘Lasang'品種的基因型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。發(fā)現(xiàn)WAT1相關(guān)蛋白是主要負(fù)責(zé)跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性的細(xì)胞壁蛋白，該基因在‘Tripo'花蕾中的早花和中花發(fā)育時期表達(dá)下調(diào)，對其結(jié)實能力和種子產(chǎn)量都有負(fù)面影響；NIP4-1是水通道蛋白基因家族成員，在‘Lasang'中的早花和中花階段顯著上調(diào)，提高該品種的種子產(chǎn)量；ZFP4在早花和中花階段高度表達(dá)，增強結(jié)實；ERF106是APETALA2(AP2)基因家族一部分，在‘Lasang'花蕾的早花和中花階段過度表達(dá)，在‘Tripo'后花階段表達(dá)下調(diào)，控制種子重量；Pt4屬于調(diào)控植物細(xì)胞磷穩(wěn)態(tài)的基因，在中花和后花階段過表達(dá)，提高種子產(chǎn)量。在紅三葉品種中對上述基因研究表明，這些基因均在不同開花時期出現(xiàn)了基因表達(dá)上的差異，進(jìn)而對種子的結(jié)實能力以及種子的產(chǎn)量產(chǎn)生影響。

Navarro等[66]使用深度測序技術(shù)調(diào)查長日照植物地三葉(Trifolium subterraneum)在3個時間點的不同光譜下的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)以地三葉為模型的長日照植物在FR光下會加速與開花途徑相關(guān)基因的上調(diào)，結(jié)果表明COL和WNK5-like蛋白介導(dǎo)富含F(xiàn)R光下的開花啟動。

3.2.3 白羽扁豆開花基因研究

Adhikari等[67]通過檢測白羽扁豆(Lupinus albus)F1、F2和F2衍生的F3代，在兩個育種群體中研究開花時間的遺傳，發(fā)現(xiàn)白羽扁豆開花受兩個互補的顯性基因Ef1和Ef2控制：當(dāng)兩個顯性基因都存在時(Ef1_、Ef2_)，表型為早花；當(dāng)兩個顯性基因都不存在時(ef1ef1、ef2ef2)，表型延遲開花；如果只有一個基因存在(Ef1_、ef2ef2或ef1ef1、Ef2_)，表型是中等的。

4 展望

開花是牧草重要的生命過程，是眾多基因控制的數(shù)量性狀。其調(diào)控對于牧草生存和繁殖至關(guān)重要，受到環(huán)境條件和發(fā)育規(guī)律的影響，這種影響牽涉復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號。因此，牧草開花的分子機(jī)理研究對控制牧草的開花進(jìn)程起重要作用，同時可以有效解決牧草產(chǎn)量低、質(zhì)量差和經(jīng)濟(jì)效益低下等問題，進(jìn)而培育優(yōu)良品種，實現(xiàn)牧草的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。目前，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對于牧草開花機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，已形成逐步完熟的開花體系，但仍有問題尚未解決。

首先，目前對于開花調(diào)控分子機(jī)理的關(guān)注主要集中在擬南芥、水稻、小麥等模式植物中，對多年生牧草的開花研究很少，所以當(dāng)前植物界開花機(jī)制的適用性還需進(jìn)一步深入。

其次，盡管開花特異性信號傳導(dǎo)途徑的基因功能在非模型牧草中是非常保守的，但是這些基因的功能特異性有時是不同的。有些基因并非在相同的植物物種中具有相同的功能，其基因功能可能根據(jù)環(huán)境條件特別是季節(jié)長度的緯度變化而發(fā)生改變。

此外，雖然FT基因調(diào)控牧草開花的研究越來越深入，但其作用機(jī)制仍存在很多問題。FT基因如何調(diào)控下游基因，F(xiàn)T在開花途徑交匯節(jié)點如何整合信號等問題都需進(jìn)一步探索。為研究FT轉(zhuǎn)運機(jī)制，人們提出很多方法。其中篩選FT互作蛋白法有助于進(jìn)一步研究FT調(diào)控開花的分子機(jī)理，同時有助于發(fā)掘FT蛋白調(diào)控其他生長發(fā)育的功能；GI基因參與多條開花途徑，并與其他基因相互作用，但是其確切的分子功能仍不清楚，如何受晝夜節(jié)律調(diào)控，如何控制CO的表達(dá)等都需進(jìn)一步深入研究。對草類植物MADS-box基因的研究很少，因此有必要繼續(xù)擴(kuò)大研究范圍以補充MADS-box基因的作用機(jī)制。

如果以上問題可以解決，牧草開花作用機(jī)制的研究將會更加透徹。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和生物信息學(xué)的發(fā)展，將會有更多的遺傳信息被發(fā)現(xiàn)，這對牧草培育具有重要意義。