謝鳳行,周可,張峰峰,趙瓊,趙玉潔,孫海波,王姝
(天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,天津,300384)
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化經(jīng)營模式的提高,殘存餌料的腐爛、生物代謝物和生物殘?bào)w沉積,使池塘有機(jī)污染嚴(yán)重,此外,人類生活污水、各種工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)退水等的超量排放,進(jìn)一步污染了養(yǎng)殖用水水源,使養(yǎng)殖環(huán)境惡化,養(yǎng)殖病害泛濫[1-3]。化學(xué)類藥品雖然在水質(zhì)調(diào)控和疾病防治方面起到了積極的作用,但化學(xué)類藥物的濫用帶來了藥物在魚蝦體內(nèi)大量富集殘留和病原菌的抗藥性等問題[4],導(dǎo)致水產(chǎn)品質(zhì)量的下降,既危害了人類健康,也污染了環(huán)境,歐盟現(xiàn)已明令禁止在動(dòng)物生產(chǎn)中使用抗生素。由酵母菌和乳酸菌組成的微生態(tài)制劑不僅可提高飼料的轉(zhuǎn)化利用率,促進(jìn)動(dòng)物生長,還可調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動(dòng)物消化道的微生態(tài)平衡,產(chǎn)生免疫活性物質(zhì),激活免疫系統(tǒng)提高養(yǎng)殖動(dòng)物的健康水平[5-6];施與水體還能降低水體中氨氮和亞硝態(tài)氮含量,有效凈化水質(zhì)[7]。
由酵母菌和乳酸菌組成的復(fù)合微生態(tài)制劑大多是由單一菌劑分別發(fā)酵后按一定比例混合而成,此種方法工作量較大,且單獨(dú)發(fā)酵后混合存在染菌風(fēng)險(xiǎn)。混合發(fā)酵又稱混菌發(fā)酵,指采用2種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成某發(fā)酵過程的一種新型發(fā)酵技術(shù),與單株菌發(fā)酵相比顯著縮短了發(fā)酵時(shí)間,提高發(fā)酵效率,節(jié)約生產(chǎn)成本[8]。有研究表明,酵母菌和乳酸菌有協(xié)同共生作用,可以混合發(fā)酵[9-10],但目前相關(guān)文獻(xiàn)主要集中在單一菌株發(fā)酵技術(shù)方面[11-14],也有將酵母菌和乳酸菌進(jìn)行組合發(fā)酵食品的研究報(bào)道[15],鮮見酵母菌和乳酸菌同步混合發(fā)酵技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。本項(xiàng)目組研制了一種高效微生態(tài)制劑EM12[7],該制劑由產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)組成,前期試驗(yàn)證明該制劑可提高魚蝦對飼料的消化吸收率,調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[16]。本研究擬采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的方法,以提高菌劑的有效活菌濃度為目標(biāo),對EM12液體和固體混合發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行了研究,并在室內(nèi)模擬條件下和田間魚蝦混養(yǎng)池塘中研究其水質(zhì)凈化效果,為菌劑的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
1.1.1 試驗(yàn)菌種
用于混合發(fā)酵的產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)菌種均為本室從水產(chǎn)養(yǎng)殖池底泥中分離保存。
1.1.2 培養(yǎng)基
產(chǎn)朊假絲酵母菌種培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基,植物乳桿菌菌種培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基。
在本室優(yōu)化的乳酸菌培養(yǎng)基基礎(chǔ)上[17],設(shè)計(jì)了6種液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(表1),培養(yǎng)基正交試驗(yàn)各因子水平見表2。
固體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選共設(shè)了7個(gè)不同的培養(yǎng)基配方(g),1:麩皮60,玉米粉40,葡萄糖3.0,蛋白胨1.0,酵母膏1.0;2:麩皮100,葡萄糖2,尿素0.5,K2HPO40.8;3:麩皮60,玉米粉40,尿素0.8,K2HPO40.8;4:玉米粉100,葡萄糖20,氯化鈉8;5:豆粕40、麩皮40、玉米粉20、葡萄糖10;6:豆粕40,麩皮40,玉米粉20,葡萄糖2,K2HPO40.4;7:豆粕40,麩皮40,玉米粉20,葡萄糖2,檸檬酸氫二銨0.2,K2HPO40.4。
表1 培養(yǎng)基成分篩選 單位:g/L
表2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)的各因素及水平 單位:g/L
1.1.3 試驗(yàn)試劑和儀器
本研究所用酵母膏、蛋白胨、葡萄糖為北京奧博星生產(chǎn),其他化學(xué)試劑由天津江天化工生產(chǎn)。
CX31顯微鏡,日本奧林巴斯;MLS-3780高壓滅菌鍋,日本三洋;UV-2550紫外可見分光光度計(jì),日本島津;BioTech-3000 200 L二聯(lián)罐,上海保興;ZSD-1270培養(yǎng)箱和ZHWY-B2102C恒溫?fù)u床,上海智誠;SW-CJ-2F超凈工作臺,蘇州凈化;BSA2202S-CW電子天平,德國賽多利斯;Seven Easy pH計(jì),瑞士梅特勒-托利多。
1.2.1 EM12液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
在250 mL玻璃瓶裝200 mL培養(yǎng)基,滅菌后接10 mL 菌種(V(酵母菌)∶V(乳酸菌)=1∶1),34 ℃靜置培養(yǎng),培養(yǎng)期間搖動(dòng)2次,1 d后取樣測定酵母菌和乳酸菌濃度,并測菌液pH值。酵母菌測定參照GB 4789.15—2016中方法,乳酸菌測定參照GB 4789.35—2016中方法,pH值測定采用pH計(jì)。
1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化
采用單因子試驗(yàn)研究不同初始pH(設(shè)4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對EM12混合發(fā)酵的影響;發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí),不同接種量1%、2%、3%、5%、7%、10%;接種量為3%時(shí),不同溫度20、25、30、35 ℃對EM12混合發(fā)酵的影響,方法同1.2.1。
1.2.3 發(fā)酵罐放大試驗(yàn)
采用200 L發(fā)酵罐進(jìn)行放大試驗(yàn),共設(shè)計(jì)4個(gè)處理,處理1:通氣8 h后停止通氣,通氣量1.5 m3/h;處理2:通氣4 h后停止通氣,通氣量1.5 m3/h;處理3:不通氣;處理4:僅接種植物乳桿菌,在24 h取樣測菌液pH、植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母的濃度。發(fā)酵時(shí)裝液量150 L,拌轉(zhuǎn)速100 r/min,接種量3%,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵周期24 h。
1.2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分篩選
采用1 L耐高溫帶蓋的PP塑料瓶作為發(fā)酵容器,每瓶裝混合均勻的干物料(麩皮、玉米粉、豆粕)100 g蓋好蓋滅菌,另用250 mL三角瓶裝水100 mL,將麩皮、玉米粉、豆粕之外的成分根據(jù)不同配方按比例加入水中,滅菌冷卻至室溫,取20 mL菌種加入含水及部分營養(yǎng)成分的三角瓶中,搖勻接入PP瓶中,將蓋擰緊,30 ℃培養(yǎng)2 d,取10 g發(fā)酵后的樣品于90 mL 無菌水中25 ℃振蕩30 min后測pH、產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌的有效活菌濃度。
1.2.5 固體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化
采用單因子試驗(yàn)測量不同發(fā)酵溫度(18、25、30、35 ℃,接種量5%,含水率50%)、不同含水率(30%、40%、50%、60%,接種量5%,25 ℃培養(yǎng))、不同接種量(1%、3%、5%、7%、10%,基質(zhì)含水率50%,25 ℃培養(yǎng))對EM12菌固體混合發(fā)酵的影響,操作方法同1.2.4。
1.2.6 水質(zhì)凈化效果研究
模擬污水:取外塘魚蝦混養(yǎng)池水,加入一定量的亞硝酸鈉,使水體中亞硝態(tài)氮的初始質(zhì)量濃度為45.0 mg/L。將3.5 L玻璃容器中裝3 L模擬污水,按1%的量分別加入液體菌劑和固體菌劑,以不添加菌劑的為對照,置于30 ℃培養(yǎng)箱中,分別于24、48、72 h取樣測水體中的亞硝態(tài)氮、氨氮和pH值。
EM12在魚蝦混養(yǎng)池的應(yīng)用,養(yǎng)殖池面積50畝,使用量為每次每畝500 g固體菌劑,10 d使用1次,全池潑灑。2017年6月13日測定值為使用前初始值,6月14日開始使用,持續(xù)試驗(yàn)2個(gè)月到2017年8月14日,期間定期取樣取水測水體亞硝態(tài)氮、氨氮、pH值。
本文所有指標(biāo)測定均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),采用Excel 2013 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),樣品之間的差異采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),顯著性分析通過Duncan進(jìn)行多重比較,正交試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析。
由表3可知,所試6種培養(yǎng)基的pH值均降低到3.2以下,其中處理6菌濃度最高,植物乳桿菌的有效活菌濃度達(dá)到5.07×109CFU/mL,顯著高于其他處理,產(chǎn)朊假絲酵母的有效活菌濃度也達(dá)到11.52×106CFU/mL,高于其他處理,pH值為3.10,說明處理6利于EM12混合菌生長。處理6相對處理4只增加MnSO4,但植物乳桿菌濃度為處理4的2.3倍,說明Mn2+對植物乳桿菌的生長有明顯的促進(jìn)作用,可能是因?yàn)镸n2+是葡萄糖激酶、醛縮酶、變位酶、磷酸烯醇化酶、丙酮酸激酶等主要酶的激活劑,這與王欣等的研究結(jié)果一致[18]。乳酸菌為EM12中的優(yōu)勢菌群,因此后續(xù)試驗(yàn)中選用植物乳桿菌活菌濃度高的6號培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。
表3 培養(yǎng)基成分篩選結(jié)果Table 3 The results of culture medium composition screening
注:表中字母不同表示差異顯著(P<0.05),下表同。
正交分析結(jié)果表明(見表4),利于植物乳桿菌生長的組合為A1B2C1D3,即葡萄糖20.0 g/L、酵母膏8.0 g/L、乙酸鈉4.0 g/L、檸檬酸氫二銨3.0 g/L,從極差大小分析可知,各因子對植物乳桿菌生長影響的主次依次為:酵母膏>檸檬酸氫二銨>乙酸鈉>葡萄糖;利于產(chǎn)朊假絲酵母生長的組合為A1B2C2D2,即葡萄糖20.0 g/L、酵母膏8.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L,從極差大小分析可知,各因子對產(chǎn)朊假絲酵母生長影響的主次依次為:葡萄糖>酵母膏>乙酸鈉>檸檬酸氫二銨。表5方差分析結(jié)果表明,酵母膏、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉對植物乳桿菌生長有顯著影響;所試的培養(yǎng)基成分對產(chǎn)朊假絲酵母生長均無顯著影響。
由于得到的2個(gè)組合均不在所設(shè)的9個(gè)處理當(dāng)中,對其進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),混合菌在組合A1B2C1D3培養(yǎng)基中發(fā)酵后,植物乳桿菌濃度達(dá)6.67×109CFU/mL,產(chǎn)朊假絲酵母濃度達(dá)1.67×107CFU/mL,pH為3.30;在組合A1B2C2D2培養(yǎng)基中發(fā)酵后,產(chǎn)朊假絲酵母濃度達(dá)2.42×107CFU/mL,植物乳桿菌濃度達(dá)5.01×109CFU/mL,發(fā)酵參數(shù)得到有效驗(yàn)證??紤]到EM12中乳酸菌為優(yōu)勢菌,在后續(xù)試驗(yàn)中選用A1B2C1D3組合配方。
表4 乳酸菌和酵母菌的直觀分析結(jié)果Table 4 Intuitive analysis results of lactic acid bacteria and yeast
注:L代表乳酸菌、Y代表酵母菌,K1、K2、K3分別為對應(yīng)列指標(biāo)的平均值,R為極差。
表5 乳酸菌和酵母菌方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of lactic acid bacteria and yeast
注:L代表乳酸菌、Y代表酵母菌,“*”表示差異顯著(P<0.05)。
2.3.1 不同初始pH對EM12生長的影響
培養(yǎng)環(huán)境的pH變化會影響細(xì)胞中各種酶的活性及細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的利用速率,從而影響菌體細(xì)胞生長和產(chǎn)物的合成[19]。由圖1可知,pH值對發(fā)酵液活菌數(shù)有顯著影響(P<0.05),在所試的初始pH濃度范圍內(nèi),植物乳桿菌的有效活菌濃度呈先升后降的趨勢,在pH 6.0時(shí)植物乳桿菌的濃度顯著高于其他處理,有效活菌濃度達(dá)到了4.61×109CFU/mL。產(chǎn)朊假絲酵母的濃度整體均較低,這可能跟靜置培養(yǎng)有關(guān)。植物乳桿菌濃度高的處理,其產(chǎn)朊假絲酵母濃度相對較低,說明此2種菌雖然存在協(xié)同互補(bǔ)作用,可以混合發(fā)酵,但共同發(fā)酵時(shí)也存在一定的營養(yǎng)競爭。綜合分析,pH 6.0利于混合菌發(fā)酵,在將來的發(fā)酵中控制發(fā)酵液pH為6.0左右,利于菌體細(xì)胞生長。
圖1 初始pH對EM12發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of initial pH on EM12 fermentation注:圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05),下圖同。
2.3.2 不同接種量對EM12發(fā)酵的影響
由表7可以看出,發(fā)酵液植物乳桿菌的有效活菌濃度隨接種量呈先升高后降低的趨勢,其中3%接種量顯著高于其他處理,接種量大于7%以后,菌液濃度顯著降低,可能是取樣點(diǎn)菌液已進(jìn)入了衰亡期,菌體細(xì)胞出現(xiàn)了自溶;發(fā)酵液產(chǎn)朊假絲酵母菌濃度為(1.05~5.25)×107CFU/mL,7%~10%接種量處理酵母菌的濃度顯著高于其他處理;菌液pH值在3.44~3.84,處理之間差異不顯著。
表6 不同接種量對EM12菌發(fā)酵的影響Table 6 Effects of different inoculation amount on EM12 fermentation
乳酸菌濃度高的處理,酵母菌的濃度則相對較低,與2.3.1中結(jié)果一致,說明此2種菌同時(shí)存在互補(bǔ)作用和營養(yǎng)競爭作用。
2.3.3 不同溫度對EM12菌發(fā)酵的影響
發(fā)酵溫度是影響菌體細(xì)胞生長繁殖的重要因素之一,溫度對菌株的生長代謝有調(diào)節(jié)作用。不同溫度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(圖2),混合菌中植物乳桿菌的有效活菌濃度隨溫度的升高呈先升后降的趨勢,25~30 ℃處理有效活菌濃度較高,35 ℃處理的有效活菌濃度又顯著降低。不同取樣點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn),20 ℃處理,72 h達(dá)到活菌濃度最高;25 ℃發(fā)酵48 h有效活菌濃度最高,達(dá)5.13×109CFU/mL;而30 ℃只需發(fā)酵24 h,植物乳桿菌的有效活菌濃度就能達(dá)到5.30×109CFU/mL。從上述結(jié)果可知,在不同的溫度條件下發(fā)酵,菌株達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間不一樣,其最終的有效活菌濃度也差異顯著,這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高,酶反應(yīng)速率加快,菌株生長代謝加速,而溫度過高又會導(dǎo)致酶失活,從而使菌株提前進(jìn)入衰亡期,可見保持合適的發(fā)酵溫度才能保證酶的活性,從而利于菌株發(fā)酵[20]。
圖2 不同溫度對植物乳酸菌生長的影響Fig.2 Effects of temperature on Lactobacillus plantarum
產(chǎn)朊假絲酵母的有效活菌濃度總體較低(圖3),這跟酵母菌是好氧菌,與發(fā)酵過程中未通氣有關(guān)。
圖3 不同溫度對EM12產(chǎn)朊假絲酵母菌生長的影響Fig.3 Effects of temperature on Candida utilis
不同溫度比較發(fā)現(xiàn),在所試的溫度范圍內(nèi),酵母菌有效活菌濃度隨溫度的升高呈降低的趨勢,在20 ℃ 下酵母菌生長相對較好,發(fā)酵72 h,有效活菌濃度達(dá)到4.00×107CFU/mL。不同溫度不同取樣點(diǎn)的有效活菌濃度變化規(guī)律與植物乳桿菌一致,即20 ℃ 處理發(fā)酵72 h達(dá)到最高點(diǎn),25 ℃在48 h達(dá)到最高點(diǎn),而30~35 ℃處理,24 h就能達(dá)到最高點(diǎn)。由于EM12混合菌中植物乳桿菌是優(yōu)勢功能菌,綜合分析,EM12混合菌最適發(fā)酵溫度為30 ℃,在此溫度下發(fā)酵24 h植物乳桿菌的有效活菌濃度分為5.30×109CFU/mL。
2.3.4 發(fā)酵罐放大試驗(yàn)
由表7可知,不同的通氣時(shí)間對植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母生長的影響都比較顯著,植物乳桿菌的濃度隨通氣時(shí)間延長而降低,產(chǎn)朊假絲酵母則相反,這可能跟產(chǎn)朊假絲酵母為好氧菌而植物乳桿菌為堿性厭氧菌有關(guān)。EM12混合發(fā)酵在不通氣的情況下,植物乳桿菌的有效活菌濃度可達(dá)6.70×109CFU/mL,為植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵濃度4.40×109CFU/mL的1.5倍,這可能是產(chǎn)朊假絲酵母的存在,可以消耗發(fā)酵罐中的余氧,為植物乳桿菌的發(fā)酵提供厭氧環(huán)境,另外產(chǎn)朊假絲酵母的代謝產(chǎn)物可為植物乳桿菌生長提供營養(yǎng)因子[21]。這也說明,混合發(fā)酵可以提高發(fā)酵效率。
表7 發(fā)酵罐放大試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The results of fermentation tank amplification test
2.4.1 培養(yǎng)基篩選
豆粕和玉米粉為微生物固體發(fā)酵常用的碳氮源,但豆粕和玉米粉吸水后均容易結(jié)塊,通氣性差,不利于酵母菌生長,因此本試驗(yàn)多數(shù)的處理均添加了一定量的麩皮。不同配方進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(表8),不同培養(yǎng)基對混合菌發(fā)酵影響較大,其中6號培養(yǎng)基(m(豆粕)∶m(麩皮)∶m(玉米粉)=2∶2∶1,每100 g物料中加葡萄糖2 g,K2HPO40.4 g)上植物乳桿菌濃度最高,濕培養(yǎng)基上活菌含量達(dá)到7.43×109CFU/g,顯著高于其他處理,產(chǎn)朊假絲酵母濃度也達(dá)到了6.25×107CFU/g濕培養(yǎng)基,因此,確定6號為后續(xù)試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基。
表8 不同配方發(fā)酵結(jié)果Table 8 The fermentation result of different cultures
2.4.2 不同溫度對EM12混合發(fā)酵的影響
發(fā)酵溫度是影響菌株固體發(fā)酵水平的重要因素之一,一方面隨著溫度升高細(xì)胞的蛋白質(zhì)活性和酶活性增強(qiáng),生化反應(yīng)加快,從而促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖,但部分溫敏的酶和核酸會隨溫度升高而遭到破壞,從而抑制細(xì)胞生長。由表9可知,在料水比為1∶1,接種量10%時(shí)發(fā)酵,產(chǎn)朊假絲酵母在18、25 ℃生長較好,在18 ℃發(fā)酵72 h,每克濕培養(yǎng)基的菌體濃度達(dá)到了億級水平,這與液體發(fā)酵結(jié)果比較一致。植物乳桿菌在所試溫度范圍內(nèi),最高活菌濃度都達(dá)到每克濕培養(yǎng)基66億以上,其中25 ℃生長最好,48 h達(dá)到8.60×109CFU/g濕培養(yǎng)基,到72 h菌濃度有不同程度降低,說明發(fā)酵48 h即可停止發(fā)酵;48 h所有處理10倍稀釋液的pH值都降低到了4.91以下。綜合比較發(fā)現(xiàn),EM12固體發(fā)酵在25 ℃發(fā)酵效果較好。
表9 不同溫度對EM12固體發(fā)酵的影響Table 9 Effects of temperature on EM12 solid fermentation
2.4.3 物料含水率對EM12混合發(fā)酵的影響
物料含水率是固體發(fā)酵能否成功的關(guān)鍵因素之一,含水率過高會導(dǎo)致多孔性和通透性降低,而含水率過低使基質(zhì)的膨脹性降低、水的張力增加,從而抑制微生物生長[22]。EM12置于25 ℃培養(yǎng)48 h,植物乳桿菌的含水率隨基質(zhì)的含水率升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(圖4),其中含水率為50%時(shí),植物乳桿菌的濃度顯著高于其他處理,達(dá)到1.36×1010CFU/g濕培養(yǎng)基;不同含水率基質(zhì)中酵母菌的濃度則整體呈現(xiàn)降低趨勢,但各處理之間菌體濃度差異不顯著,最低為1.0×108CFU/g濕培養(yǎng)基,最高的為30%含水率處理,達(dá)2.40×108CFU/g。這也說明基質(zhì)含水率越低,其通透性越強(qiáng),越利于酵母菌生長。由于EM12中乳酸菌為優(yōu)勢菌群,因此,混合菌發(fā)酵的含水率優(yōu)選50%。
圖4 含水率對EM12固體發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of moisture content on EM12 solid fermentation
2.4.4 不同接種量對混合菌發(fā)酵的影響
接種量也是固體發(fā)酵不可忽視的一個(gè)因子,接種量大可以使發(fā)酵快速啟動(dòng),但接種量過高又會導(dǎo)致菌體細(xì)胞吸收不到足夠的營養(yǎng)成分從而抑制生長,接種量過低會使發(fā)酵周期延長,從而增加染菌的風(fēng)險(xiǎn)。在本試驗(yàn)中,植物乳桿菌的有效活菌濃度隨接種量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(圖5)。
圖5 不同接種量對EM12發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of inoculation amount on EM12 solid fermentation
其中7%接種量處理的乳酸菌濃度最高,達(dá)到1.64× 1010CFU/g濕培養(yǎng)基,顯著高于其他處理,所有處理植物乳桿菌的濃度超過1.00×1010CFU/g濕培養(yǎng)基;不同接種量處理酵母菌濃度比較接近,在(1.00~2.70) ×108CFU/g;處理組之間比較發(fā)現(xiàn),7%接種量混合菌的總體有效活菌數(shù)最高,乳酸菌濃度達(dá)1.64×1010CFU/g,酵母菌濃度達(dá)1.65×108CFU/g,且10-6稀釋液中未檢出雜菌。
2.5.1 室內(nèi)模擬水體水質(zhì)凈化結(jié)果
由圖6可知,EM12液體菌劑和固體菌劑對模擬水體中的亞硝態(tài)氮有顯著去除效果。其中液體菌劑處理24 h,對模擬廢水中45.0 mg/L亞硝態(tài)氮的去除率為79.1%,48 h去除率達(dá)到89.8%,去除速率達(dá)到0.84 [mg/(L·h)];固體菌劑處理24 h,亞硝態(tài)氮的去除率達(dá)到99.7%,去除速率達(dá)到1.87 [mg/(L·h)],液體菌劑和固體菌劑在去除亞硝態(tài)氮的同時(shí)不累積氨氮。此外,EM12顯著降低了水體的pH(圖7),72 h, 液體菌劑處理水體的pH值低于對照0.1~0.3單位,固體菌劑處理水體的pH值低于對照0.4~1.3單位。
圖6 EM12對亞硝態(tài)氮去除效果Fig.6 The nitrite-N removal effect by EM12
圖7 EM12對水體pH影響Fig.7 The effect on pH by EM12
2.5.2 EM12在外塘中的使用效果
6月13日測定值為使用前初始值,6月14日開始使用,試驗(yàn)持續(xù)2個(gè)月,到8月14日。從表10可知,EM12能高效去除水體中亞硝態(tài)氮、氨氮,去除率分別達(dá)90%、84%,到試驗(yàn)后期亞硝態(tài)氮和氨氮維持在一個(gè)較低的水平,對pH有明顯的降低作用,試驗(yàn)期間養(yǎng)殖池水質(zhì)清爽,魚蝦攝食活躍。室內(nèi)模擬試驗(yàn)和田間試驗(yàn)結(jié)果說明,EM12有較強(qiáng)的水質(zhì)凈化效果,可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化。
表10 EM12在養(yǎng)殖池中的使用效果Table 10 The application effect of EM12 on breeding pond
混合發(fā)酵是在純種發(fā)酵基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型發(fā)酵技術(shù),目前的研究大多還是關(guān)于同屬不同種微生物進(jìn)行混合發(fā)酵[8,23]。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的方法對酵母菌和乳酸菌的混合發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行了研究,確定了其最佳的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明,EM12液體混合發(fā)酵在優(yōu)化的工藝條件下發(fā)酵,液體菌劑發(fā)酵24 h,植物乳桿菌的濃度達(dá)6.70×109CFU/mL, 為單菌發(fā)酵4.4×109CFU/mL的1.5倍,產(chǎn)阮假絲酵母菌的濃度達(dá)到了2.00×107CFU/mL;固體菌劑發(fā)酵48 h,乳酸菌的濃度達(dá)到1.64×1010CFU/g 濕培養(yǎng)基,酵母菌濃度達(dá)1.65×108CFU/g濕培養(yǎng)基,且主要成分為農(nóng)副產(chǎn)品下腳料。本研究中混合發(fā)酵植物乳桿菌的濃度高于植物乳桿菌單一發(fā)酵,與劉喬等研究混合發(fā)酵活菌濃度低于單菌發(fā)酵的結(jié)果不一致,可能是酵母菌生長代謝產(chǎn)生的丙酮酸、維生素、氨基酸等物質(zhì)促進(jìn)了乳酸菌生長代謝[21]。但在液體混合發(fā)酵試驗(yàn)中,乳酸菌濃度高的處理其酵母菌的含量相對較低,這說明此2種菌也存在一定的營養(yǎng)競爭作用,至于在什么情況下能使其協(xié)同共生作用最大發(fā)揮,什么情況下使其營養(yǎng)競爭作用降到最低,這有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。
本研究對混合菌劑的水質(zhì)凈化效果進(jìn)行了評價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn),固體菌劑處理24 h能將模擬水體中45.0 mg/L的亞硝態(tài)氮徹底去除,液體菌劑處理48 h亞硝態(tài)氮去除率達(dá)89.8%,且不累積氨氮。前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌單株菌72 h能將11.5 mg/L亞硝態(tài)氮徹底去除,優(yōu)于已有報(bào)道的乳酸菌[17]。說明混合菌劑對亞硝態(tài)氮的去除效果優(yōu)于單一菌劑,具體是因?yàn)榫w細(xì)胞濃度提高了還是酵母菌也在其中發(fā)揮了積極作用,需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。另外,外塘試驗(yàn)也表明,EM12對水體中亞硝態(tài)氮、氨氮均有較好的去除效果,可用于養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化。
綜上可見,EM12混合發(fā)酵,不僅提高了發(fā)酵效率,同時(shí)提高了菌劑的有效活菌濃度,保證了菌劑質(zhì)量,且菌劑的水質(zhì)凈化能力也得到了提升,為EM12的規(guī)?;a(chǎn)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。