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    走馬胎中大葉紫金牛酚的分離鑒定與生物活性評(píng)價(jià)

    2019-04-04 08:16:24陳錦蘭吳浩祥胡銳紅肖文靜袁捷
    關(guān)鍵詞:走馬大葉培養(yǎng)箱

    陳錦蘭, 吳浩祥, 胡銳紅, 肖文靜, 袁捷

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    走馬胎中大葉紫金牛酚的分離鑒定與生物活性評(píng)價(jià)

    陳錦蘭1, 吳浩祥2*, 胡銳紅3, 肖文靜4, 袁捷4

    (1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510405; 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣州 510405; 3. 佛山市氣象局, 廣東 佛山 528000; 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院,廣州 510006)

    為了解走馬胎()的化學(xué)成分,從其乙酸乙酯提取物中分離鑒定出大葉紫金牛酚。體外活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明,大葉紫金牛酚具有良好的抗炎、抗腫瘤活性以及一定的神經(jīng)保護(hù)作用。這是首次對(duì)大葉紫金牛酚進(jìn)行系統(tǒng)研究,為綜合開發(fā)與利用走馬胎提供科學(xué)依據(jù)。

    紫金牛科;走馬胎;大葉紫金牛酚;生物活性

    大葉紫金牛酚[1]是具有順式取代的十七碳直鏈烯烴的間苯二酚衍生物,因大量存在于紫金???Myrsinaceae)植物大葉紫金牛()中,并成為其特征性成分。大葉紫金牛酚結(jié)構(gòu)獨(dú)特,母體為苯酚結(jié)構(gòu),連接長鏈烯烴取代基,致使化合物脂溶性顯著提高;此外苯環(huán)結(jié)構(gòu)上帶有易發(fā)生氧化反應(yīng)的酚羥基活潑基團(tuán),同時(shí)側(cè)鏈烯烴基團(tuán)處于不穩(wěn)定的順式取代模式。大葉紫金牛酚獨(dú)特新穎的結(jié)構(gòu)吸引了藥物化學(xué)家們的研究興趣。Guan等[2]對(duì)大葉紫金牛酚進(jìn)行了抗肺結(jié)核活性研究,并揭示其具有潛在的抗肺結(jié)核活性。然而目前對(duì)大葉紫金牛酚的研究還是嚴(yán)重不足的,繼續(xù)深入研究、開發(fā)與評(píng)價(jià)其新穎生物活性將具有顯著意義。

    大葉紫金牛在我國廣東、廣西、江西、云南等地有分布;其干燥根及根莖即為跌打損傷良藥走馬胎。作為嶺南民間常用中藥,走馬胎始載于清代《生草藥性備要》[3],有祛風(fēng)除濕、壯筋骨、活血化瘀等功效,主治風(fēng)濕筋骨疼痛、產(chǎn)后血瘀、癰疽潰瘍等[4]??梢?,走馬胎具有多方面的生物活性;此外,近年來的現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),走馬胎還具有多種藥理作用,如抗腫瘤、抗血栓和抗氧化作用等[5–6]。

    鑒于走馬胎多種藥理活性已被證實(shí),現(xiàn)代臨床將之用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[7]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[8]、骨質(zhì)增生癥[9]、骨傷骨折[10]等疾病的治療,效果顯著,引起了對(duì)走馬胎包括化學(xué)成分和藥理學(xué)在內(nèi)全面研究的熱潮。隨著研究的深入,走馬胎多種化學(xué)成分被陸續(xù)報(bào)道,主要包括苯酚類、香豆精類、三萜皂苷類、甾醇類等成分[5]。然而目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)走馬胎化學(xué)成分的研究,一直側(cè)重于三萜皂苷類和巖白菜素類化學(xué)成分,未見基于走馬胎臨床藥效對(duì)大葉紫金牛酚進(jìn)行全面和深入的研究。同時(shí),大葉紫金牛酚作為走馬胎的主要活性成分,闡明其藥理活性,將為明確走馬胎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),同時(shí)合理使用走馬胎提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 儀器、試劑和耗材

    質(zhì)譜:Waters 3100 SQDMS (低分辨ESI);核磁共振譜:Bruker Avance III 500型核磁共振儀, 以氘代試劑殘留溶劑峰為內(nèi)標(biāo);液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀:Waters 2695 LC偶聯(lián)Waters Acquity ELSD、Waters3100 SQDMS,分析色譜柱型號(hào):Waters Sunfire?RP C-18,3.5m, 4.6 mm×100 mm;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司);垂直超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司);低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo fisher公司);超低溫冰箱(日本三洋SANYO公司);FM-500型倒置熒光生物顯微鏡(上海普丹光學(xué)儀器有限公司);TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

    Cell Counting Kit-8 (CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);Greiss NO試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);MTT噻唑蘭(美國Sigma公司);叔丁基過氧化氫(t-BHP)(成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司);200~300、300~400目柱層析硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn));HSGF254 TLC預(yù)制薄層板(德國Merck公司);葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala,Sweden);CHP20P MCI樹脂(75~150m) (Mitsubishi Chemical Corporation);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國CORNING公司);胎牛血清(FBS) (澳大利亞Gibco公司);青-鏈霉素(P/S)(Thermo公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(德國Biological Industries公司);DMSO溶液(美國Sigma公司);HPLC分析用乙腈(Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水由美國Millipore公司純水、超純水系統(tǒng)提供;其他有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品;TLC顯色劑為5%香蘭素乙醇液。

    1.2 材料

    走馬胎15 kg,2017年12月購于中山市健禾中藥飲片有限公司,標(biāo)本號(hào)No. 20171201。

    1.3 細(xì)胞株

    炎癥細(xì)胞株:脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核細(xì)胞RAW264.7; 腫瘤細(xì)胞株:人非小細(xì)胞肺癌A549和人大細(xì)胞肺癌NCI-H460; 神經(jīng)細(xì)胞株:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y。均來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

    1.4 大葉紫金牛酚的提取和分離

    走馬胎(15 kg),粉碎后用95%工業(yè)酒精室溫浸泡3次,每次5 d,合并提取液,減壓濃縮至無乙醇味。將得到的總浸膏用水懸浮,然后用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮萃取液,得到乙酸乙酯部位800 g。將乙酸乙酯部位用MCI柱層析處理,以乙醇-水(50%、70%、95%乙醇)為流動(dòng)相梯度洗脫,得到3個(gè)組分A、B和C。

    結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)特征,首先對(duì)組分C (605 g)用硅膠(200~300目)柱層析,正己烷∶乙酸乙酯[10∶1~1∶1,/(下同)]梯度洗脫,薄層(TLC)檢測(cè)合并,共獲到6個(gè)子組分B1~B6。

    組分B2經(jīng)凝膠柱層析,氯仿∶甲醇(1∶1)洗脫,得到3個(gè)子組分B2A~B2C;B2B經(jīng)硅膠(300~400目)柱層析,正己烷∶乙酸乙酯(10∶1~1∶1)洗脫,最后獲得化合物1 (102 g),含量約為0.68%。

    1.5 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1 棕色油狀物, ESI-MS: 347.28 [M + H]+,1H NMR (500 MHz, CDCl3):H6.18 (1H, s, H-2), 6.24 (1H, s, H-4), 6.24 (1H, s, H-6), 2.35 (2H, t,= 7.2 Hz, H-1′), 1.56 (2H, m, H-2′), 1.27 (2H, over- lapped, H-3′), 1.27 (2H, overlapped, H-4′), 1.27 (2H, overlapped, H-5′), 1.27 (2H, overlapped, H-6′), 2.01 (2H, overlapped, H-7′), 5.35 (1H, overlapped, H-8′), 5.35 (1H, overlapped, H-9′), 2.01 (2H, overlapped, H- 10′), 1.27 (2H, overlapped, H-11′), 1.27 (2H, over- lapped, H-12′), 1.27 (2H, overlapped, H-13′), 1.27 (2H, overlapped, H-14′), 1.27 (2H, overlapped, H-15′), 1.27 (2H, overlapped, H-16′), 0.88 (3H, t,= 6.5 Hz, H- 17′)。以上數(shù)據(jù)與大葉紫金牛酚(圖1)[11]的一致。

    圖1 大葉紫金牛酚結(jié)構(gòu)式

    1.6 大葉紫金牛酚的生物活性篩選

    體外抗炎活性篩選 采用比色法[11–12],用NO試劑盒測(cè)定小鼠巨噬細(xì)胞的NO。將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7以5′105濃度接種于96孔板中,置于37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。然后加入10% FBS、LPS和大葉紫金牛酚,輕輕搖晃96孔板,然后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),18 h后取100L培養(yǎng)基上清液,加入Greiss試劑,室溫放置10 min, 然后以完全培養(yǎng)基加顯色劑作為空白對(duì)照,在420 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(OD值)。陽性對(duì)照:l-氮甲基精氨酸(l-NMMA)。

    體外抗腫瘤活性篩選 采用MTT法[13],通過測(cè)定大葉紫金牛酚對(duì)A549和NCI-H460細(xì)胞的增殖抑制作用來評(píng)價(jià)。將MTT溶于磷酸緩沖液(PBS),配成濃度為5 mg mL–1的MTT溶液備用。取對(duì)數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞,以RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1′105cfu mL–1,接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔加入100L,然后分別加入2、4、8、12和16g mL–1大葉紫金牛酚100L,每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基)。置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,每孔加入5 mg mL–1的MTT溶液30L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在160×下離心22 min,棄上清液,每孔加入100L DMSO溶解。酶標(biāo)儀快速震蕩60 s后,570 nm波長處測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和IC50。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對(duì)照)×100%。陽性對(duì)照:多柔比星。

    體外神經(jīng)保護(hù)活性篩選 用MTT法[13]檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞的存活率。將SH-SY5Y細(xì)胞以6×109L–1的濃度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿中,加入含有10% FBS和1% P/S的DMEM培養(yǎng)基,置37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天全量換液1次,隔天傳代,并在顯微鏡下進(jìn)行觀察。將SH- SY5Y細(xì)胞以6×105L–1的濃度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中,每孔100L。將細(xì)胞分為0 (正常組)、50、100和200mol L–1的t-BHP組,每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí),吸凈培養(yǎng)基,加入含有相應(yīng)濃度t-BHP的培養(yǎng)基,置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、6、12和24 h,觀察SH-SY5Y細(xì)胞衰老情況。將SH-SY5Y細(xì)胞以6×109L–1的密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中,每孔100L。將細(xì)胞分為正常組、模型組、給藥組(含有25、50、100和200g mL–1大葉紫金牛酚的模型組),每組6個(gè)復(fù)孔。置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察大葉紫金牛酚對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞衰老的保護(hù)情況。

    2 結(jié)果和討論

    2.1 大葉紫金牛酚抗炎活性評(píng)價(jià)

    盡管在嶺南民間,走馬胎一直被用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種炎癥類疾病,療效也同時(shí)被現(xiàn)代臨床學(xué)研究所證實(shí);然而走馬胎治療炎癥類疾病的藥效基礎(chǔ)一直未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過大葉紫金牛酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用來評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,大葉紫金牛酚具有良好的體外抗炎活性,IC50為17.85mol L–1。因此,大葉紫金牛酚為走馬胎治療炎癥類疾病的藥效基礎(chǔ)之一。

    2.2 大葉紫金牛酚抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

    現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),走馬胎具有抗腫瘤作用[5–6], 并表明三萜皂苷類成分是走馬胎抗腫瘤作用的藥效物質(zhì)之一。大葉紫金牛酚作為走馬胎中主要化學(xué)成分之一,但尚未見報(bào)道其是否具有抗腫瘤作用。本試驗(yàn)通過大葉紫金牛酚對(duì)A549和NCI-H460細(xì)胞的增殖抑制作用來評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,大葉紫金牛酚具有中等抗腫瘤作用,對(duì)A549和NCI-H460腫瘤細(xì)胞的IC50分別為38.01和12.21mol L–1。

    2.3 大葉紫金牛酚神經(jīng)保護(hù)活性評(píng)價(jià)

    細(xì)胞衰老是指正常細(xì)胞在通路調(diào)控下不可逆地進(jìn)入生長停滯期,在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞核膜崩解、細(xì)胞膜脆性增加、選擇性通透能力下降、多種細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性形變等狀態(tài)[14–17]。為綜合開發(fā)與利用走馬胎,本試驗(yàn)通過探討大葉紫金牛酚是否可以延緩SH-SY5Y細(xì)胞衰老來評(píng)價(jià)其是否具有神經(jīng)保護(hù)作用[18–19]。結(jié)果表明(圖2),不給藥的模型組對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率有抑制作用,而不同濃度的大葉紫金牛酚則不同程度地對(duì)t-BHP的抑制作用有所逆轉(zhuǎn)。因此,大葉紫金牛酚對(duì)SH- SY5Y細(xì)胞衰老有保護(hù)作用,并且與濃度有依賴關(guān)系。

    圖2 MTT法測(cè)定SH-SY5Y的存活能力

    3 結(jié)論

    本研究對(duì)大葉紫金牛酚進(jìn)行了系統(tǒng)研究,首次報(bào)道大葉紫金牛酚的抗炎、抗腫瘤以及神經(jīng)保護(hù)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大葉紫金牛酚具有良好的抗炎和抗腫瘤活性,以及具有一定的神經(jīng)保護(hù)活性。明確了大葉紫金牛酚是走馬胎治療炎癥類疾病和抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一,為綜合開發(fā)與利用走馬胎提供科學(xué)依據(jù)。

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    Isolation, Identification and Biological Evaluation of Gigantifolinol from

    CHEN Jin-lan1, WU Hao-xiang2*, HU Rui-hong3, XIAO Wen-jing4, YUAN Jie4

    (1. Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405, China; 2. The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405, China; 3.Foshan Meteorological Bureau,Foshan 528000, Guangdong, China; 4. Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006, China)

    In order to understand the chemical constituents of, the gigantifolinol were isolated and identified from EtOAc extract.activity screening, gigantifolinol showed potent anti-inflammatory and anti-tumor activities, and moderate neuroprotection activities. This is the first systematic study of gigantifolinol, which might provide a scientific basis to the development and utilization of.

    Myrsinaceae;; Gigantifolinol; Biological activity

    10.11926/jtsb.4018

    2018-11-13

    2018-12-21

    廣東省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放運(yùn)行費(fèi)(2017B030314096)資助

    This work was supported by the Open Operation Cost of Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Development and Research of Chinese Medicine (Grant No. 2017B030314096).

    陳錦蘭,女,在讀碩士研究生,研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。E-mail: mizi04@126.com

    E-mail: gzwhx2010@163.com

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