酸酯堿成分結(jié)合指紋圖譜優(yōu)選鹽黃柏炮制工藝

程中琴，劉小妹，施崇精，王姍姍，盛 蓉，袁強(qiáng)華，宋 英

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 610075;2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610072

黃柏來源于蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。習(xí)稱“川黃柏”[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。[2]該藥味苦、性寒，歸腎、膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡之效。用于濕熱瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、腳氣、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒、濕疹瘙癢等病的治療，為臨床常用藥[3]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為生黃柏性味苦寒，清熱燥濕、瀉火解毒作用強(qiáng)，但苦寒過甚，應(yīng)用不當(dāng)易傷脾胃；鹽炙后可緩和苦寒之性，不易傷脾胃，并借鹽引藥入腎之功而增強(qiáng)滋陰瀉相火之力[4]。根據(jù)2015年版《中國藥典》的附錄ⅡD鹽水炙法中對鹽制黃柏規(guī)定：“取凈藥材，加鹽水拌勻，悶透，置鍋內(nèi)，以文火加熱，炒至規(guī)定的程度時，取出，放涼。每100 kg凈藥材用食鹽2 kg?！盵1]但對黃柏的鹽制工藝如炮制溫度和時間、炒藥量并未做明確規(guī)定。本文以指紋圖譜全面反映藥材的化學(xué)成分，以鹽黃柏中三大類主要成分(生物堿和酸類、酯類)為指標(biāo)，定性定量的分析不同炮制工藝，以期為進(jìn)一步規(guī)范黃柏鹽炙工藝，確保良好的臨床效果。通過探討影響黃柏鹽炙工藝的幾個因素，為制定黃柏鹽制的合理炮制工藝標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260-Ⅱ型HPLC儀，包括四元泵、DAD檢測器、在線脫氣裝置、Openl AB工作站(Agilent公司，美國)；BP211D型十萬分之一電子分析天平(Mettler-Toledo公司，瑞士)；AS20500BD 型超聲清潔儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；CXP-500A 型高速多功能粉碎機(jī)(上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司)；MS-5型炒貨機(jī)(邁斯機(jī)械)。

1.2 試藥

對照品鹽酸小檗堿(批號:15401-69-1，純度98.0%)，鹽酸小檗紅堿(批號633-65-8，純度為 98%)，巴馬汀(批號10605-02-4，純度98.0%)，木蘭花堿(批號:2141-9-5，純度98.0%)，黃柏內(nèi)酯(批號：1180-71-78，純度99.03%)，異綠原酸B(批號：1453461-3，純度98.97%)，3.5-O-二咖啡酰奎寧酸(批號：89919-62-0，純度99.25%)，均購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；鹽酸黃柏堿(批號:111895-201504，純度94.9%)，鹽酸藥根堿(批號:110733-201609，純度89.5%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。生黃柏(批號：170721)，由四川省中藥飲片有限責(zé)任公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院盛蓉主任藥師鑒定為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮。乙腈、甲醇(天地公司，美國，色譜純)，水為純化水(怡寶水)，未加碘精制鹽(廠家：中鹽榆林有限公司；批號：201707041S)其余試劑為分析純。

2 分析方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿、木蘭花堿、鹽酸小檗紅堿、黃柏堿、巴馬汀、藥根堿、3.5-O-二咖啡?？帷惥G原酸B、黃柏內(nèi)酯25.46、10.88、7.51、9.66、10.10、11.09、8.55、6.43、9.25 mg，分別置 10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得各對照品儲備液。精密移取各生物堿對照品儲備液1 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。得到鹽酸小檗堿、木蘭花堿、鹽酸小檗紅堿、黃柏堿、巴馬汀、藥根堿質(zhì)量濃度分別為249.5、106.6、73.6、91.7、99.0、99.1 μg/mL 的混合對照品溶液。置4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 HLPC色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 5 μm 4.6×250 mm；流相：乙腈A-0.1%磷酸B(15∶85、PH=2.10)，進(jìn)行梯度洗脫(見表1)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：327 nm。

表1 梯度洗脫表

圖1 不同炮制溫度下鹽黃柏三類主要成分HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of three main components of Phellodendron chinensis under different processing temperatures注：S1 120 ℃；S2 140 ℃；S3 160 ℃；S4 180 ℃；S5 200 ℃；1 異綠原酸B；2 3.5-O-二咖啡?？?；3黃柏內(nèi)酯；4黃柏堿；5木蘭花堿；6藥根堿；7巴馬?。?鹽酸小檗紅堿；9鹽酸小檗堿。Note:S1 120 ℃；S2 140 ℃；S3 160 ℃；S4 180 ℃；S5 200 ℃；1 Isochlorogenic acid B； 2 3.5-Isochlorogenic acid；3 obakulactone;4 Phellodendrine;5 magnoflorine；6 jateorhizine;7 palmatine;8 berberubine;9 berberine.

2.1.3 供試品溶液得制備

精密稱取鹽黃柏藥材粉末(過三號篩)1.0 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入25 mL鹽酸：甲醇(1∶100)混合溶液，稱定重量，超聲處理1 h，冷卻后加入鹽酸：甲醇(1∶100)混合溶液，補(bǔ)足失去的重量，靜置，取上清液過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2 單因素炮制工藝考察

2.2.1 炮制溫度考察

稱取100 g黃柏飲片10份，按每 100 g 藥材加入2 g未加碘精制鹽的比例，分別加入40 mL水將2 g鹽溶解，用噴壺均勻噴灑在藥材表面，并置密閉容器中悶潤60 min，分別120、140、160、180、200 ℃炮制15 min，粉碎，按2.1.3進(jìn)行含量測定。記錄峰面積，計算含量，結(jié)果見表2、圖1。

表2 炮制溫度對鹽黃柏指標(biāo)成分含量影響(mg/g)

實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，炮制溫度對鹽黃柏得炮制有一定影響，特別是鹽酸小檗紅堿的含量，隨著溫度得升高，鹽酸小檗紅堿含量增加，以及內(nèi)酯成分亦有所提高，并且溫度過低，鹽黃柏不易炒干，但溫度過高容易炒焦，故綜合考慮，最終確定鹽黃柏炮制溫度范圍為120～180 ℃。

2.2.2 炮制時間考察

稱取100 g黃柏飲片10份，按每100 g 藥材加入2 g鹽的比例，分別加入40 mL水將2 g鹽溶解，用噴壺均勻噴灑在藥材表面，并置密閉容器中悶潤90 min，在150 ℃炮制10、15、20、25、30 min，粉碎，按2.1.3進(jìn)行含量測定。記錄峰面積，計算含量，結(jié)果見表3、圖2。

結(jié)論：鹽黃柏炮制時間不同，生物堿總量變化較小，但個別成分得含量變化較大，炮制溫度不同，炮制時間亦有相應(yīng)調(diào)整，但為節(jié)約生產(chǎn)成本，應(yīng)將其炒藥時間控制在30 min以內(nèi)，并且時間過長，會使黃柏飲片炒焦，此外，時間太短，鹽黃柏未炒干，會影響黃柏的儲存，綜上所述，本實(shí)驗(yàn)最終確定時間范圍為15～25 min。

圖2 不同炮制時間下鹽黃柏三類主要成分HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of three main components of Phellodendron chinensis under different processing time注：S1 10 min；S2 15 min；S3 20 min；S4 25 min；S5 30 min；1 異綠原酸B；2 3.5-O-二咖啡?？?；3黃柏內(nèi)酯；4黃柏堿；5木蘭花堿；6藥根堿；7巴馬汀；8鹽酸小檗紅堿；9鹽酸小檗堿。Note:S1 10 min；S2 15 min；S3 20 min；S4 25 min；S5 30 min；1 Isochlorogenic acid B； 2 3.5-Isochlorogenic acid;3 obakulactone；4 Phellodendrine;5 magnoflorine;6 jateorhizine；7 palmatine;8 berberubine;9 berberine.

炮制時間Processed temperature(min)生物堿總量Alkaloid3.5-O-二咖啡?？?3.5-Isochlorogenic acid異綠原酸BIsochlorogenic acid B黃柏內(nèi)酯Obakulactone水分Water(%)10 min-160.819537.38651.47048.152925.36 10 min-253.592834.31061.43727.605525.7515 min-157.390936.97321.44438.062418.74

續(xù)表3(Continued Tab.3)

炮制時間Processed temperature(min)生物堿總量Alkaloid3.5-O-二咖啡酰奎酸 3.5-Isochlorogenic acid異綠原酸BIsochlorogenic acid B黃柏內(nèi)酯Obakulactone水分Water(%)15 min-254.974735.01811.33857.824018.7620 min-157.272536.23131.49188.035912.2020 min-254.094535.25151.35627.595212.9825 min-154.951238.01611.34537.416310.4425 min-258.079639.07761.43548.028910.4230 min-152.659234.05341.34158.12837.2730 min-253.738634.32421.38267.52607.31

2.2.3 炒藥量考察

分別取生黃柏飲片50、100、150、200、250、300 g飲片各2份，分別按每100 g藥材加入40 mL水(含2 g鹽)的比例，浸潤60 min，150℃炮制15 min，粉碎，按2.1.3進(jìn)行含量測定。記錄峰面積，計算含量。結(jié)果見表4、圖3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炒藥量對各類成分影響較小，炒藥量對炮制品的影響主要與所配置機(jī)器容量得總體積相關(guān)，調(diào)查多個藥廠，根據(jù)多名炒藥師傅多年炮制經(jīng)驗(yàn)，炒藥量一般不多于炒藥機(jī)總?cè)萘?/4，本實(shí)驗(yàn)所用炒藥機(jī)所容納黃柏飲片總量約為1 200 g,炒藥量太少容易炒焦甚至炒碳，影響飲片質(zhì)量，炒藥量過多容易造成飲片翻炒不均勻，部分飲片未炒干，影響飲片的儲存，最終確定正交炒藥范圍為100 g～300 g。

圖3 不同炒藥量下鹽黃柏三類主要成分HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprint of three main components of Phellodendron chinensis under different processing amount注：S1 50g；S2 100g；S3 150g；S4 200g；S5 250g；1 異綠原酸B；2 3.5-O-二咖啡?？幔?黃柏內(nèi)酯；4黃柏堿；5木蘭花堿；6藥根堿；7巴馬??；8鹽酸小檗紅堿；9鹽酸小檗堿。Note:S1 50g；S2 100g；S3 150g；S4 200g；S5 250g；1 Isochlorogenic acid B； 2 3.5-Isochlorogenic acid;3 obakulactone;4 Phellodendrine;5 magnoflorine;6 jateorhizine;7 palmatine;8 berberubine;9 berberine.

炒藥量Processed amount(g)生物堿總量Alkaloid3.5-O-二咖啡酰奎酸 3.5-Isochlorogenic acid異綠原酸BIsochlorogenic acid B黃柏內(nèi)酯Obakulactone50g-142.730829.90811.04534.586750g-241.741829.71231.45874.7394100g-144.844432.67351.09655.0910100g-243.376531.89351.00995.2639150g-142.966328.43001.00095.0139150g-242.082029.50220.96905.2438200g-141.596927.24290.99115.3217200g-242.239629.10611.05065.0719250g-139.982127.39800.80985.4976250g-245.685228.75171.06336.1125

2.3 AHP法確定各指標(biāo)成分權(quán)重

根據(jù)各成分藥效作用以及各成分含量多少，將指標(biāo)成分含量作為權(quán)重予以量化，即將4個指標(biāo)成分分成4個層次，并確定各指標(biāo)得優(yōu)先順序：生物堿總量>3.5-二咖啡?？?黃柏內(nèi)酯>異綠原酸B。以此構(gòu)成成對比較的優(yōu)先矩陣，并獲得各指標(biāo)的相對評分，指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣見表5。

表5 指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣

根據(jù)表5評分結(jié)果，AHP法計算生物堿總量、3.5-二咖啡?？?、黃柏內(nèi)酯、異綠原酸B各項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.466 8、0.277 6、0.160 3、0.095 3，一致性比例因子CR=0.007 3<0.1,即指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣具有一致性，權(quán)重系數(shù)有效。

2.4 正交設(shè)計優(yōu)選炮制工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選炒制溫度、炒制時間、炒藥量三個因素三水平優(yōu)選炮制工藝。根據(jù)因素和水平數(shù)，選擇L9(34)正交表。因素、水平設(shè)定和實(shí)驗(yàn)安排見下表。

表6 正交因素水平表

表7 正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果

2.5 提取工藝的確定

采用AHP法得到的權(quán)重系數(shù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評分，利用SPSS 19.0對正交結(jié)果進(jìn)行分析，直觀分析結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表8 正交試驗(yàn)綜合評分結(jié)果

表9 方差分析

注：F0.05(2,2)=99.0。

Note:F0.05(2,2)=99.0.

圖4 正交實(shí)驗(yàn)HLPC指紋圖譜Fig.4 HLPC fingerprint of orthogonal design

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的炮制工藝對鹽黃柏個別成分影響較大，直觀分析表明，影響炮制工藝的主次為：A>C>B，A因素對綜合評分具有顯著影響，得最佳工藝為A3B3C2，但由于B因素和C因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，考慮工業(yè)化大生產(chǎn)，為節(jié)約成本，同時保證飲片炒干，最終確定炮制工藝為：A3B2C3，即180 ℃，炒20 min，加入容器體積1/4飲片量。

2.6 正交驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取300g黃柏飲片(三份)，分別加入80 mL鹽水(含4 g鹽)，悶潤90 min，放入預(yù)熱至180 ℃炒藥機(jī)翻炒20 min，粉碎，過篩，按“2.1項(xiàng)”進(jìn)行含測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RSD<5%，該工藝穩(wěn)定、可行，可運(yùn)用于鹽黃柏炮制工藝生產(chǎn)。

表10 驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 指紋圖譜分析

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽黃柏不同炮制品均存在這9個共有峰，但各成分含量有一定差異。不同炮制品中生物堿總量變化較小，主要變化成分為鹽酸小檗紅堿及黃柏內(nèi)酯。鹽酸小檗紅堿可能是由于加熱使某些成分發(fā)生了轉(zhuǎn)變，研究發(fā)現(xiàn)黃柏炮制后，小檗紅堿含量增加是由鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)化而來。但不同炮制溫度對化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化有所不同，研究發(fā)現(xiàn)，加碘鹽和非加碘鹽黃柏內(nèi)酯含量相差較大，其主要原因可能是碘使其溶出率的變化所致。黃柏生熟藥效有異，生品性寒而沉；鹽炙后緩和苦燥之性，不傷脾胃，引藥下行入腎，增強(qiáng)資腎陰、瀉腎火的作用。通過指紋圖譜比較，發(fā)現(xiàn)黃柏炮制前后存在化學(xué)成分的變化，這可能是導(dǎo)致其藥效發(fā)生變化的原因。[4]

3.2 鹽黃柏飲片質(zhì)量評價

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同鹽黃柏炮制品各類成分含量不呈正比趨勢增長，故以單一成分來評價藥材質(zhì)量的優(yōu)劣是不全面的，需多成分，多指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮。本實(shí)驗(yàn)通過三類有效成分的精確定量測定，為鹽黃柏藥材質(zhì)量的控制和評價提供更好技術(shù)參考[5-7]，并結(jié)合指紋圖譜，定性定量得反映鹽黃柏質(zhì)量，為本課題接下來進(jìn)一步鹽黃柏的炮制工藝參數(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

3.3 炮制工藝的確定

本實(shí)驗(yàn)初期采用單因素實(shí)驗(yàn)，確定各影響因素的范圍，[8]篩選出對鹽黃柏質(zhì)量影響較大的炮制影響因素，并采用正交設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用多成分、多方面評價，[9]使篩選工藝更具科學(xué)性、可行性，所篩選的工藝對鹽黃柏炮制穩(wěn)定、可行，適用于實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)一步驗(yàn)證，同時該試驗(yàn)為闡釋黃柏的炮制機(jī)理提供了一定的參考依據(jù)，所建立的方法也可用于鹽黃柏的質(zhì)量控制。