基于高效液相指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量法的防風(fēng)藥材及其偽品的鑒別

張 丹，木盼盼，郭 梅，鄭開(kāi)顏，李國(guó)川，侯芳潔，郭 龍*，鄭玉光*

1河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；2河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，石家莊 050200

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，具有祛風(fēng)解表，勝濕止痛，止痙的功效，主要用于感冒頭痛，風(fēng)濕痹痛，風(fēng)疹瘙癢，破傷風(fēng)等癥[1]。近年來(lái)防風(fēng)需求量日益增大，而野生藥材資源日益減少，難以滿足市場(chǎng)需要，栽培防風(fēng)逐漸成為市場(chǎng)的主流。目前，防風(fēng)藥材品質(zhì)差異較大，主要體現(xiàn)在規(guī)范化種植防風(fēng)所占面積較小以及地方習(xí)用品的混入，造成主流市場(chǎng)真?zhèn)位祀s、質(zhì)量良莠不齊。現(xiàn)代研究表明，防風(fēng)含有色原酮類、香豆素類、有機(jī)酸、多糖類、聚炔類、甾醇類等多種化學(xué)成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗驚厥等作用[2,3]。其中所含的色原酮類成分，是其發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗氧化作用的主要活性成分[4-8]?？梢?jiàn)，對(duì)于防風(fēng)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)可從其所含色原酮類成分著手，測(cè)定色原酮類成分含量，以初步對(duì)防風(fēng)藥材的質(zhì)量及真?zhèn)芜M(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)以其中色原酮類成為作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，借助高效液相色譜法對(duì)防風(fēng)藥材及其偽品進(jìn)行區(qū)分，以期完善防風(fēng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，并建立基于HPLC法的防風(fēng)藥材的真?zhèn)舞b別手段。

1 材料

1.1 試驗(yàn)設(shè)備

島津LC-20 A高效液相色譜儀(日本島津制作所)；Shimadzu inertsil ODS-2高效液相色譜柱 C18(5 μm,4.6 × 250 mm)；BSA224S-CW電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；KQ2200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)試劑

乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific Co.Ltd.)，甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific Co.Ltd.)，水為超純水，其余試劑均為分析純；升麻素苷(批號(hào)PRF7040523，純度 > 98% )，升麻素(批號(hào)PRF7090123，純度>98%)，5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào)PRF7083021，純度>98%)，亥茅酚苷(批號(hào)PRF7083022，純度>98%)均購(gòu)自于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材

27批藥材購(gòu)買(mǎi)于各地藥材市場(chǎng)，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鄭玉光教授鑒定為防風(fēng)S.adivaricata(Turcz.)Schischk.(關(guān)防風(fēng)、口防風(fēng))、葛縷子CarumcarviL.(小防風(fēng))、竹葉西風(fēng)芹SeselimaireiWolff.(云防風(fēng))、寬萼巖風(fēng)Libanotislaticalycina(水防風(fēng))的干燥根，憑證標(biāo)本保存于河北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)研究室。具體見(jiàn)表1。

表1 防風(fēng)樣品詳細(xì)信息

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號(hào)No.產(chǎn)地Growing area品種Cultivated varietiesS22甘肅岷縣Min Country,Gansu小防風(fēng)XiaofangfengS23甘肅定西Dingxi,Gansu小防風(fēng)XiaofangfengS24甘肅甘南Gannan,Gansu小防風(fēng)XiaofangfengS25云南大理Dali,Yunnan云防風(fēng)YunfangfengS26云南大理Dali,Yunnan云防風(fēng)YunfangfengS27云南楚雄Chuxiong,Yunnan云防風(fēng)Yunfangfeng

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Inertsil ODS-2 C18(5 μm,4.6 × 250 mm)；流動(dòng)相乙腈 (A)-水溶液 (B)梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0～20 min，15%～25% A，20～30 min，25%～50% A，30～40 min，50%～50% A)，流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；按升麻素苷計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2 000。對(duì)照品及樣品(S1)圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 防風(fēng)藥材(S1)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC Chromatogram of Saposhnikoviae Radix注：A.對(duì)照品；B.樣品(S1)；1.升麻素苷；2.升麻素；3.5-O-甲基維斯阿米醇苷；4.亥茅酚苷。Note:A.Reference substance;B.Sample (S1)；1.Prim-O-glucosylcimifugin；2.Cimifugin；3.4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol；4.Sec-O-glucosylhamaudol.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品適量，用甲醇溶解配制升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的對(duì)照品混合溶液，濃度分別為0.080、0.018 4、0.081 6、0.040 8 mg/mL。

2.3 供試品溶液的制備

防風(fēng)藥材粉碎過(guò)40目篩，干燥至恒重，精密稱取樣品粉末約l g(詳見(jiàn)表3)，放在具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱重，水浴回流提取2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，以0.22 μm濾膜過(guò)濾。取續(xù)濾液，即得。

3 結(jié)果

3.1 防風(fēng)藥材4種成分含量測(cè)定

3.1.1 線性關(guān)系考察

將混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋成一系列梯度濃度的溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2，各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2 精密度試驗(yàn)

將混合對(duì)照品溶液，按照“2.1項(xiàng)”下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算4種成分的RSD(n=6)，考察精密度。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷的RSD分別為0.97%、0.59%、1.14%、1.64%，表明儀器精密度良好。

表2 防風(fēng)4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一防風(fēng)(S4)供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明防風(fēng)供試品溶液在制備后48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批防風(fēng)(S4)粉末約1 g，平行6份(取樣量分別為1.001 5、1.001 1、1.001 2、1.001 1、0.999 8、1.000 9 g)，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法處理，得供試品溶液，按照“2.1項(xiàng)”下色譜條件分別進(jìn)樣，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD都小于3.0%，相對(duì)峰面積的RSD都小于3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量(S4)的防風(fēng)藥材樣品約0.5 g，平行6份，精密稱定(取樣量分別為0.500 5 、0.501 1、0.499 8、0.501 2 、0.500 1、0.500 9 g)，分別加入4種對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，計(jì)算4種成分的加樣回收率。升麻素苷，升麻素，5-O-甲基維斯阿米醇苷，亥茅酚苷的平均回收率分別為99.8%、97.9%、102.4%、101.5%；RSD值分別為2.3%、1.9%、1.2%、1.5%。

3.1.6 樣品的含量測(cè)定

按照2.3項(xiàng)下方法制備27批供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定27批樣品中升麻素苷，升麻素，5-O-甲基維斯阿米醇苷，亥茅酚苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 27批防風(fēng)樣品中4種成分的含量

續(xù)表3(Continued Tab.3)

編號(hào)No.取樣量Weight(g)升麻素苷Prim-O-glucosylcimifugin(%)升麻素Cimifugin(%)5-O-甲基維斯阿米醇苷4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol(%)亥茅酚苷Sec-O-glucosylhamaudol(%)升麻素苷+5-O-甲基維斯阿米醇苷Prim-O-glucosylcimifugin+4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol(%)S191.00120.0214----S201.0009-----S210.99790.0479----S220.9995-----S231.0015-----S241.00430.01620.0040---S251.00050.05800.0085---S261.00020.08250.0107---S271.0019-0.0041---

注：-表示未檢測(cè)到。

Note:-Indicated no detection.

由含量測(cè)定結(jié)果可知，小防風(fēng)和云防風(fēng)均無(wú)法檢測(cè)到《中國(guó)藥典》2015版規(guī)定的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷；但河南水防風(fēng)的含量測(cè)定的指標(biāo)滿足藥典的規(guī)定，即升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的總量不得少于0.24%[1]，通過(guò)對(duì)4個(gè)成分的定量還發(fā)現(xiàn)，水防風(fēng)中升麻素的含量要高于正品防風(fēng)，亥茅酚苷的含量則低于正品防風(fēng)，具體的規(guī)律需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。因此，通過(guò)HPLC法可將小防風(fēng)和云防風(fēng)鑒別為偽品，但水防風(fēng)滿足藥典標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)際應(yīng)用中要注意鑒別?？梢?jiàn)通過(guò)HPLC的含量測(cè)定方法在防風(fēng)鑒別上具有一定的局限性。

3.2 防風(fēng)的指紋圖譜研究

鑒于HPLC法在防風(fēng)真?zhèn)舞b別上的局限性，為了更加突出不同來(lái)源防風(fēng)的差異，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)借助HPLC指紋圖譜的方法區(qū)分真?zhèn)畏里L(fēng)，以期更加全面評(píng)價(jià)不同來(lái)源的防風(fēng)藥材及其偽品。

3.2.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一防風(fēng)樣品(S4)供試品溶液，連續(xù)同一條件進(jìn)樣6次，以1號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%。

3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一防風(fēng)(S4)供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0、2、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣，以1號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明供試品溶液在制備后48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批防風(fēng)( S4)粉末約1 g，平行6份，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法處理，得供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄特征圖譜，以1號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

圖2 27批防風(fēng)藥材HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 27 batches about Saposhnikoviae Radix

3.2.4 指紋圖譜相似度分析

27批防風(fēng)樣品的色譜圖見(jiàn)圖2，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版”對(duì)所得色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以S1作為參比圖譜，采用中位數(shù)法，在時(shí)間窗寬度為0.10時(shí)，確定共有峰9個(gè)，生成對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖3。6個(gè)不同品種的防風(fēng)藥材指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比對(duì)，各樣品之間的相似度為0.087～0.997之間，相似度結(jié)果見(jiàn)表4。由結(jié)果可知防風(fēng)與其偽品之間的相似度較差，突出表現(xiàn)為小防風(fēng)、云防風(fēng)、水防風(fēng)與正品防風(fēng)的區(qū)別性；而正品防風(fēng)之間則具有較好的相似度。因此，所建立的防風(fēng)藥材的指紋圖譜可用于防風(fēng)藥材的鑒別。

3.3 結(jié)合化學(xué)計(jì)量法的防風(fēng)藥材的真?zhèn)舞b別

為了驗(yàn)證已建立的防風(fēng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，同時(shí)進(jìn)一步說(shuō)明不同等級(jí)的防風(fēng)藥材的內(nèi)在品質(zhì)差異，本研究運(yùn)用系統(tǒng)聚類分析和主成分分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確保結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

圖3 防風(fēng)藥材的對(duì)照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprint of Saposhnikoviae Radix

No.相似度SimilarityNo.相似度SimilarityNo.相似度SimilarityS10.983S100.870S190.286S20.986S110.997S200.087S30.982S120.976S210.144S40.930S130.974S220.233S50.993S140.982S230.151S60.982S150.884S240.400S70.988S160.948S250.703S80.980S170.854S260.810S90.893S180.786S270.266

3.3.1 系統(tǒng)聚類分析

利用系統(tǒng)聚類分析可將具有相似性的樣品歸為一類的特點(diǎn)。用SPSS 22.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)27批樣品進(jìn)行聚類分析，將4個(gè)色原酮成分的百分含量作為原變量，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，聚類方法采用組間連接法及平方歐式距離法，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4

圖4 防風(fēng)藥材聚類分析樹(shù)狀圖Fig.4 Hierarchical cluster analysis of Saposhnikoviae Radix

可知，防風(fēng)藥材及其偽品可被分為2類，即關(guān)防風(fēng)和口防風(fēng)一類，栽培防風(fēng)和偽品一類。

3.3.2 主成分分析

在聚類分析的基礎(chǔ)上，采用SIMCA 13.0軟件對(duì)原變量進(jìn)行主成分分析。由主成分分析結(jié)果可知，前兩個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為94.14%，其中第一主成分貢獻(xiàn)率為74.14%，第二主成分貢獻(xiàn)率為19.99%，相關(guān)結(jié)果如圖所示(見(jiàn)圖5)。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，即可將防風(fēng)藥材基本分為正品防風(fēng)和偽品防風(fēng)，可見(jiàn)對(duì)防風(fēng)中4個(gè)成分的定量分析，可將防風(fēng)藥材及其偽品區(qū)別開(kāi)來(lái)，所建立的分析防風(fēng)可用于防風(fēng)藥材的真?zhèn)舞b別。

圖5 防風(fēng)藥材主成分分析圖Fig.5 PCA of Saposhnikoviae Radix

成份Composition初始特征值Initial eigenvalue提取平方和載入Extract square sum loading合計(jì)Total方差貢獻(xiàn)率Variance contribution rate(%)累積方差貢獻(xiàn)率Cumulative variance contribution rate(%)合計(jì)Total方差貢獻(xiàn)率Variance contribution rate(%)累積方差貢獻(xiàn)率Cumulative variance contribution rate(%)12.56674.14474.1442.56674.14474.14421.20019.99394.1371.20019.99394.13730.1463.63897.77540.0892.225100.000

根據(jù)聚類分析和主成分分析結(jié)果，結(jié)合含量測(cè)定的結(jié)果可將正品防風(fēng)和偽品防風(fēng)進(jìn)行分類，所建立的定量分析方法可用于正品防風(fēng)藥材的區(qū)分鑒別與質(zhì)量控制。

4 討論

防風(fēng)中含有色原酮類、香豆素類、揮發(fā)油類和多糖類等多種成分類型，以色原酮類為其主要活性成分[2]。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定了其中的4個(gè)色原酮類成分并建立了高效液相指紋圖譜，結(jié)果表明正品防風(fēng)各批次之間的相似度均大于0.870，與偽品的相似度比較P<0.01，說(shuō)明正品防風(fēng)與偽品防風(fēng)之間具有極顯著性差異，所建立的含量測(cè)定方法可用于防風(fēng)藥材的真?zhèn)舞b別。

為了進(jìn)一步對(duì)防風(fēng)藥材及其偽品進(jìn)行區(qū)分，借助系統(tǒng)聚類分析和主成分分析對(duì)含量測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果說(shuō)明，基于含量測(cè)定的結(jié)果可以將防風(fēng)藥材及其偽品區(qū)分開(kāi)來(lái)。所建立的基于含量測(cè)定和化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合的方法可用于防風(fēng)藥材及其偽品的鑒別。

以《中國(guó)藥典》2015版的標(biāo)準(zhǔn)，河南產(chǎn)水防風(fēng)的含量符合藥典要求[1]，而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定其中的4個(gè)色原酮類成分并建立化學(xué)指紋圖譜的方法可以將其區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明藥典的含量測(cè)定指標(biāo)在鑒定防風(fēng)藥材的真?zhèn)紊暇哂幸欢ǖ木窒扌?。因此，本?shí)驗(yàn)所建立的方法既能比較全面、綜合地比較防風(fēng)譜圖之間的相似關(guān)系，又能比較不同產(chǎn)地的防風(fēng)譜圖之間的差異，為防風(fēng)藥材的真?zhèn)舞b別提供較好的依據(jù)。