桑椹醇提物清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究

廖素鳳，劉鑫義，劉江洪,，楊志堅(jiān)，鄭金貴*

1福建農(nóng)林大學(xué) 福建省作物生物技術(shù)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2福建農(nóng)林大學(xué) 作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3福建農(nóng)林大學(xué) 福建省特種作物育種與利用工程技術(shù)研究中心，福州 350002

亞硝胺和亞硝酸鹽是環(huán)境中最常見的化學(xué)致癌物，在食物、飲料、煙草、化妝品和工業(yè)污染中普遍存在[1]。流行病學(xué)調(diào)查表明，消化道癌癥頻發(fā)與機(jī)體內(nèi)的亞硝胺類物質(zhì)有直接關(guān)系[2]。亞硝酸鹽是亞硝胺類化合物的前體物質(zhì)，在胃液環(huán)境中極易通過(guò)亞硝化反應(yīng)合成N-亞硝胺[3]。因此，研究清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的有效物質(zhì)對(duì)于預(yù)防和控制相關(guān)癌癥的發(fā)生具有重要意義。

目前關(guān)于多酚和黃酮類物質(zhì)等植物化學(xué)物質(zhì)清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的研究已有較多報(bào)道[4-6]。趙巖等[7]比較了38種藥用植物醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用，發(fā)現(xiàn)小花地筍、茜草和野生葡萄(籽)等醇提取物具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽的作用，且與總酚含量呈正向相關(guān)。范金波等[8]研究發(fā)現(xiàn)，桑椹提取物總酚和黃酮含量較藍(lán)莓和黑加侖多，其抗氧化能力也均強(qiáng)于藍(lán)莓和黑加侖，提示桑椹總酚、黃酮含量與其抗氧化活性相關(guān)。綜上所述，食用富含多酚類和黃酮類等活性物質(zhì)的各種新鮮水果、蔬菜等天然植物，可以一定程度地清除亞硝酸鹽或阻斷亞硝胺的合成。

桑椹(FructusMori)是?？粕僦参锏某墒旃耄瑸樾l(wèi)生部首批公布的“藥食同源”食品之一[9]。我國(guó)收集保存的3 000多個(gè)桑樹種質(zhì)資源分屬于15個(gè)桑種4個(gè)變種[10]，是世界上桑椹資源最多的國(guó)家。近年來(lái)研究結(jié)果表明，桑椹除含有豐富的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)外，還含有黃酮、多酚、白藜蘆醇和原花青素等活性成分[11,12]，具有抗氧化、抗腫瘤、降糖降脂和改善心血管功能等藥理作用[12,13]。

目前對(duì)多酚類、黃酮類化合物和原花青素抑制亞硝化反應(yīng)的作用研究雖然較多，但其均為對(duì)特定品種植物的研究，不具有代表性，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)桑椹活性物質(zhì)清除亞硝酸鹽和阻斷二乙基亞硝胺(NDEA)合成作用的系統(tǒng)報(bào)道。本文擬采用超聲輔助乙醇浸提的方法提取桑椹活性物質(zhì)，在體外模擬胃液條件下探討桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除和對(duì)NDEA合成的影響，同時(shí)分析不同桑椹試樣原花青素、總黃酮和總酚含量與清除亞硝酸鹽、阻斷NDEA合成作用的相關(guān)性，為研究桑椹在預(yù)防亞硝胺致癌方面的應(yīng)用價(jià)值和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 桑椹樣品

遼寧大連黑果桑、山東青島黑果桑和北京大興黑果桑鮮果(一級(jí)),購(gòu)自福州海峽果品批發(fā)交易市場(chǎng)；臺(tái)灣四季果桑46C016、臺(tái)灣四季果桑72C002、PR-01黑果桑、白珍珠果桑、AH-07果桑、野生蒙桑和推廣品種栽培蒙桑，采自福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)研究所桑樹種質(zhì)資源圃(永泰基地)，采摘時(shí)間為2017年4～5月；安徽野生桑椹冷凍果、百草味桑椹干(果脯類)購(gòu)于淘寶網(wǎng)店；新疆和田野生藥桑干、北京普濟(jì)仁堂桑椹干和安徽集澤堂桑椹干購(gòu)于市場(chǎng)藥店。上述桑椹鮮果均于采收后立即清洗，冷凍干燥后粉碎過(guò)60目篩，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

NDEA(純度>99.9%，0.1 g)、亞硝酸鈉(純度為99.999%，25 g)、沒食子酸(純度≥98%)、抗壞血酸(VC,純度≥98%)和原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,HPLC)均購(gòu)自Sigma公司；蘆丁對(duì)照品(純度≥92.5%)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；Folin-Phenol試劑，購(gòu)于索來(lái)寶有限公司；乙腈(色譜純)，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；甲醇、乙醇、碳酸鈉、檸檬酸、鹽酸、對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺和香草醛等試劑，購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 儀器

日立L-2000高效液相色譜儀(Hitachi公司，日本)，D-2000 Elite HPLC System(Hitachi 公司，日本)，Waters SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，2.5 μm，Waters公司，美國(guó))，Infinite M200 TECAN酶標(biāo)儀(TECAN公司，瑞士)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超市儀器有限公司，中國(guó))，3K-15型高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó))，美國(guó)Milli-Q Reference型超純水儀(廈門精藝興業(yè)科技有限公司，中國(guó))，ALPHA 1-2LD PLUS 凍干機(jī)(Marin Christ公司，德國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 桑椹醇提物的制備

采用乙醇為溶劑超聲輔助提取桑椹活性物質(zhì)[14]：稱取桑椹粉末3.00 g，按料液比1∶25(g∶mL)加入75%乙醇(v/v)75 mL，在超聲功率200 W、35 ℃條件下提取30 min，重復(fù)提取3次，合并提取液，過(guò)濾除渣，濾液減壓濃縮后定容，測(cè)定原花青素、總酚和總黃酮含量，剩余提取液濃縮凍干，得提取物凍干粉，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 桑椹醇提液總酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteus法測(cè)定總酚含量[15]，稍加修改。以沒食子酸質(zhì)量濃度(x，單位μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(y，單位A)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007 5x-0.012 5(R2=0.999 4)。取樣品醇提液1 mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，于波長(zhǎng)760 nm下測(cè)定吸光度。以上操作重復(fù)3次。根據(jù)回歸方程和下式計(jì)算樣品中總酚含量(以沒食子酸計(jì))。

總酚含量(mg/g) =c× V × 25 × 10-3/(m ×V1)

式中：c為比色管中樣品總酚濃度(μg/mL)，V1為反應(yīng)體系中樣品提取液體積(mL)，V為樣品提取液總體積(mL)，m為用于提取的干粉質(zhì)量(g)。

2.3 桑椹醇提液原花青素含量的測(cè)定

采用香草醛-鹽酸法[12]測(cè)定原花青素含量。以吸光度(y，單位A)為縱坐標(biāo)，原花青素質(zhì)量濃度(x，單位mg/mL)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.842 2x-0.008 5(R2=0.999 1)。取稀釋后的樣品醇提液各1 mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度。以上操作重復(fù)3次。根據(jù)原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線和下式計(jì)算樣品中原花青素含量(以原花青素計(jì))。

原花青素含量(mg/g)=c×V1×X×V/(m×V2)

式中:c為反應(yīng)液中原花青素的濃度(mg/mL)，V1為反應(yīng)液的總體積(6 mL)，X為提取液稀釋的倍數(shù)，V為待測(cè)提取液的總體積(mL)，m為用于提取的干物質(zhì)重量(g)，V2為反應(yīng)液中稀釋后的待測(cè)提取液體積(1 mL)。

2.4 桑椹醇提物總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al (Cl)3法測(cè)定總黃酮含量[16]。以吸光度(y，單位A)為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(x，單位mg/mL)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=12.633x-0.033 6(R2=0.999 1)。取各樣品醇提液0.5 mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以上操作重復(fù)3次。

總黃酮含量(mg/g)=c×V1×V/(m×V2)

式中:c為反應(yīng)液中總黃酮濃度(mg/mL)，V1為反應(yīng)液的總體積(25 mL)，V為待測(cè)提取液的總體積(mL)，m為用于提取的干物質(zhì)重量(g)，V2為反應(yīng)液中加入的測(cè)提取液體積(0.5 mL)。

2.5 桑椹醇提物對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用

2.5.1 桑椹醇提物濃度對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

將PR-01黑果桑醇提物凍干粉配置成2 mg/mL的樣品溶液(含有1.49 mg/mL原花青素)，分別吸取一定體積的上述樣品溶液用蒸餾水配成0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的待測(cè)液(相當(dāng)于原花青素濃度為6、15、30、59、119、178、238、297 μg/mL)。

在體外模擬胃液條件下(pH3.0，37 ℃)，采用鹽酸萘乙二胺法[7]測(cè)定不同桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率。在25mL容量瓶中準(zhǔn)確吸取不同濃度的桑椹醇提物待測(cè)液各1 mL，參照趙巖等[7]的反應(yīng)方法，以不加桑椹醇提物待測(cè)液的反應(yīng)液做空白，在540 nm處測(cè)定吸光值。用VC做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，用下式計(jì)算清除率：

式中：A0為不加桑椹醇提物待測(cè)液的反應(yīng)液的吸光度，A1為加入桑椹醇提物的反應(yīng)液的吸光度。

2.5.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)桑椹醇提物清除亞硝酸鹽的影響

固定桑椹醇提物待測(cè)液濃度為0.8 mg/mL，按2.5.1方法研究不同反應(yīng)時(shí)間(0、10、20、30、40、50、60、70、80 min)對(duì)桑椹醇提物清除亞硝酸鹽的影響。用VC做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

不同桑椹樣品醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用采用上述篩選的最佳醇提物濃度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行清除反應(yīng)，并比較清除率。

2.5.3 二乙基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用HPLC法檢測(cè)NDEA[17]。利用日立L-2000高效液相色譜儀的D-2000 Elite HPLC System，吸收波長(zhǎng)230 nm，Waters SunFire C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，2.5 μm)，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相：甲醇/水=50 / 50 (體積比)，柱溫30 ℃。用蒸餾水配制0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、40、60、80、100 μg/mL的NDEA標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行液相色譜測(cè)定。以NDEA 質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制NDEA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品和空白樣反應(yīng)體系中NDEA的生成量，再根據(jù)公式計(jì)算桑椹醇提物對(duì)NDEA合成的阻斷率。

式中C和C0分別為樣品和空白樣反應(yīng)體系中NDEA的生成量(μg)。

2.5.4 模擬人體胃液條件下桑椹醇提物對(duì)NDEA合成阻斷率的測(cè)定

在各試管中加入0.1 mol/L檸檬酸0.8 mL、1 mol/L二乙胺 0.1 mL和100 mmol/L亞硝酸鈉 0.1 mL，混合，分別加入2.5.1配制的不同濃度的桑椹醇提物溶液1 mL，渦旋混合調(diào)節(jié)pH至3.0。在37 ℃條件下反應(yīng)4 h后，再加入0.1 mL的1%對(duì)氨基苯磺酸混勻終止反應(yīng)。用VC做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。按2.5.3的方法進(jìn)行液相色譜測(cè)定和計(jì)算阻斷率。不同樣品桑椹醇提物對(duì)NDEA合成的阻斷實(shí)驗(yàn)采用上述篩選的最佳醇提物濃度進(jìn)行比較。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

2.6 桑椹醇提物清除亞硝酸鹽、阻斷NDEA合成的能力與其原花青素、總酚和總黃酮含量的相關(guān)性分析

本研究應(yīng)用簡(jiǎn)單的線性回歸分析15個(gè)不同桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率、對(duì)NDEA合成的阻斷率及其與醇提物中總酚、總黃酮含量之間的相關(guān)性。

2.7 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 不同試樣桑椹醇提物中原花青素、總酚和總黃酮的含量

表1 15個(gè)桑椹試樣的原花青素、總酚和總黃酮含量

注：同一指標(biāo)中不同上標(biāo)小寫字母表示樣品間差異達(dá)顯著水平 (P<0.05)，大寫字母不同，表示組間差異達(dá)極顯著水平 (P<0.01)。下同。

Note:Different superscript lowercase letters in the same index indicated a significant difference between the samples (P<0.05);Different superscript capital letters in the same index indicated a very significant difference between the samples (P<0.01).Same as below.

從表1可知，15種試樣桑椹醇提物的原花青素、總酚和總黃酮含量存在顯著差異，范圍分別為2.36±0.07 ～ 155.41±3.34 mg/g(以原花青素計(jì)，干基)、0.79±0.18 ～11.86±0.15 mg/g(以沒食子酸計(jì)，干基)和0.31±0.08 ～ 3.05±0.11 mg/g(以蘆丁計(jì)，干基)，桑椹鮮果凍干粉的醇提物中上述活性成分含量普遍高于市售桑椹干的。另外，同一季節(jié)不同產(chǎn)地(遼寧大連、山東青島和北京大興)的黑果桑原花青素和總黃酮含量存在顯著差異，不同桑椹原花青素、總酚和總黃酮含量也存在顯著差異，其中，引進(jìn)的PR-01黑果桑的總黃酮和原花青素含量均最高，分別為3.05±0.11、155.41±3.34 mg/g，是推廣品種栽培蒙桑的7.44倍和2.90倍，多酚含量最高的品種是野生蒙桑，為11.86±0.15 mg/g，是栽培蒙桑的2.52倍，而百草味桑椹干的3個(gè)活性成分含量均最低。

此外，本文還分析了PR-01黑果桑醇提物凍干粉的總酚類、總黃酮和原花青素含量。測(cè)定結(jié)果顯示，PR-01醇提物凍干粉中總酚類、總黃酮和原花青素含量分別為187.25±6.35 mg/g (以沒食子酸計(jì))、79.01±4.78 mg/g(以蘆丁計(jì))和297.12±3.34 mg/g(以原花青素計(jì))，其中原花青素含量較高，黃酮含量相對(duì)較低。

3.2 模擬胃液條件下桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除效果

3.2.1 不同桑椹醇提物濃度對(duì)亞硝酸鹽清除能力的影響

如圖1所示，隨著濃度的增大，桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率快速提高，增加到一定濃度后，清除率的增幅減緩，并趨于平穩(wěn)。當(dāng)桑椹醇提物濃度為0.8 mg/mL(其原花青素濃度為238 μg/mL)時(shí)，對(duì)25 μg NaNO2的清除率最高達(dá)92.07%，僅略微低于同等條件下維生素C的清除能力(95.67%)，表明桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的清除能力。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.8 mg/mL桑椹醇提物進(jìn)行不同試樣桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除實(shí)驗(yàn)。

3.2.2 不同作用時(shí)間下桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率的影響

由圖2可知，在模擬胃液條件(pH值 = 3，T=37 ℃)下，當(dāng)作用時(shí)間從0 min增加至60 min時(shí)，濃度為0.8 mg/mL的桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率明顯上升，增加至60 min時(shí)清除率升至最高(86.16%)，繼續(xù)增加作用時(shí)間，清除率基本保持不變，說(shuō)明在一定時(shí)間內(nèi)桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率與作用時(shí)間呈正相關(guān)，超出一定時(shí)間范圍清除率保持不變，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用60 min作為反應(yīng)時(shí)間。

圖1 模擬胃酸條件下不同桑椹醇提物濃度對(duì)亞硝酸鹽清除能力的影響Fig.1 The effect of different concentration of mulberry alcohol extract on nitrite scavenging rate under simulated gastric juice

圖2 模擬胃液條件下不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)桑椹醇提物清除亞硝酸鹽的影響Fig.2 The effect of different reaction time on nitrite scavenging rate with mulberry alcohol extracts under simulated gastric juice

3.2.3 不同桑椹試樣對(duì)亞硝酸鹽的清除率比較

由表2可知，控制桑椹醇提物的原花青素質(zhì)量濃度相同時(shí)(238 μg/mL)，15種桑椹試樣醇提物對(duì)亞硝酸鹽均具有一定的清除作用，但不同樣品的清除能力存在較大差異，其中PR-01黑果桑、山東青島黑果桑和野生蒙桑的醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率均大于80.00%，顯示出很強(qiáng)的亞硝酸鹽清除作用；遼寧大連黑果桑、臺(tái)灣四季果桑46C016、AH-07黑果桑和安徽野生桑椹冷凍果的醇提物對(duì)亞硝酸鹽清除率大于50.00%，也具有較強(qiáng)的亞硝酸鈉清除能力。另外，凍干的桑椹鮮果普遍優(yōu)于市場(chǎng)上的桑椹干，其中PR-01黑果桑的清除率最高，達(dá)92.25%，而百草味桑椹干的清除率最低，兩者相差19.38倍。

表2 15種桑椹試樣醇提物的亞硝酸鹽清除率和NDEA合成阻斷率

3.3 模擬胃酸條件下桑椹醇提物對(duì)二乙基亞硝胺形成的影響

3.3.1 二乙基亞硝胺的檢測(cè)

如圖3A所示，NDEA標(biāo)樣的色譜峰尖銳，峰形對(duì)稱，基本無(wú)拖尾現(xiàn)象，分離效果較好。樣品的典型色譜圖見圖3B，圖中所示的是0.05 mg/mL桑椹醇提物對(duì)NDEA生成的作用。NDEA峰型對(duì)稱，分離效果好，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致。以NDEA質(zhì)量濃度( μg/mL) 為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)NDEA濃度為0～100 μg/mL時(shí)，回歸方程為y=2 713.5x+ 93.792，R2=0.999 2，說(shuō)明有很好的線性關(guān)系。

圖3 二乙基亞硝胺(NDEA)的色譜圖Fig.3 The chromatogram of N-nitrosodiethylamine (NDEA)

圖4 模擬胃液條件下不同桑椹醇提物濃度對(duì)NDEA合成阻斷率Fig.4 The effect of different concentration of mulberry alcohol extract on blacking rates of NDEA synthesis under simulated gastric juice

3.3.2 桑椹醇提物濃度對(duì)NDEA合成的阻斷效果的影響

由圖4可見，在0～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，桑椹醇提物對(duì)NDEA合成的阻斷率逐漸提高，濃度大于0.6 mg/mL后，阻斷率趨于飽和，變化較小(84.01%～87.94%)。同時(shí)，在0～0.4 mg/mL范圍內(nèi)，隨著VC濃度的增加，對(duì)NDEA合成的阻斷率快速提高至91.58%，繼續(xù)增加Vc質(zhì)量濃度，二乙基亞硝胺的生成幾乎被完全抑制。本研究中桑椹醇提物和Vc對(duì)NDEA合成的阻斷能力的IC50值分別為36 μg/mL和33 μg/mL。結(jié)果表明，桑椹醇提物對(duì)NDEA合成的抑制作用趨勢(shì)與Vc基本一致，同等條件下其阻斷效果僅略低于Vc。

3.3.3 不同桑椹試樣對(duì)NDEA合成阻斷率的比較

各試樣桑椹醇提物對(duì)NDEA合成的抑制率結(jié)果見表2。由表2可知，在控制原花青素質(zhì)量相同(質(zhì)量濃度為238 μg/mL)時(shí)，15種桑椹試樣阻斷二乙基亞硝胺合成能力亦各不相同，0.8 mg/mL PR-01黑果桑和山東青島黑果桑對(duì)NDEA合成阻斷作用最大，分別達(dá)到了87.25%和87.20%，其次為野生蒙桑，阻斷率為75.48%，作用最弱的為百草味桑椹干，僅為0.97%。

3.4 各試樣桑椹醇提物清除亞硝酸鹽、阻斷NDEA合成的能力與其總酚和總黃酮含量的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示(圖5)，當(dāng)醇提物中原花青素含量相同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)供試的15種桑椹試樣醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率、NDEA合成的阻斷率與其總黃酮含量呈正向相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.829 6和0.960 8；各桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率和NDEA合成阻斷率與體系中總酚含量之間呈一定的正相關(guān)，但其相關(guān)系數(shù)較小，分別為0.529 1和0.639。以上結(jié)果表明，原花青素、多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)可能是桑椹醇提物發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽清除率、NDEA合成阻斷率與總黃酮、總酚含量的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation between nitrite scavenging rate,synthesis blocking rate of NDEA and total flavonoids content,total phenolics content of alcohol extract from fifteen mulberries samples.

4 討論

目前從桑屬植物中分離得到的化合物有近400個(gè)，以多糖、多酚類、黃酮類等活性物質(zhì)為主[18,19]。利用有機(jī)溶劑(60%～95%的乙醇)在低溫下浸提的桑椹提取物主要為黃酮類、多酚類和原花色素類等物質(zhì)[11,20,21]。本文以75%乙醇提取15種桑椹活性物質(zhì)，對(duì)其原花青素、總酚和總黃酮含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，桑椹醇提物中原花青素含量占比相對(duì)較高，總酚次之，總黃酮最少；15種桑椹醇提物的原花青素、總酚和總黃酮含量存在顯著差異，以PR-01黑果桑的總黃酮和原花青素含量均最高，野生蒙桑的多酚含量最高，并且以黑紫色桑椹鮮果總多酚含量較為豐富，該結(jié)果與閆祝煒等[15]研究結(jié)果一致。另外，3個(gè)不同產(chǎn)地的黑果桑鮮果原花青素和總黃酮含量差異較大，福建種植的PR-01黑果?？傸S酮含量(3.05 mg/g)也明顯高于周慶頌等測(cè)定[22]的四川南充的桑椹總黃酮含量(最高2.074 mg/g)?？梢?，桑椹中有效成分的含量受品種、地質(zhì)、環(huán)境、氣候的影響。

本試驗(yàn)首次系統(tǒng)評(píng)價(jià)了富含活性成分的桑椹對(duì)亞硝酸鹽的清除和NDEA生成的影響，結(jié)果顯示，在模擬胃液條件下，隨著濃度提高和反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除和阻斷NDEA合成能力有較明顯的提高，表明桑椹醇提物能在胃中有效清除亞硝酸鹽和阻斷NDEA合成，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。本試驗(yàn)中除4種桑椹干及白珍珠果桑外，其它桑椹試樣醇提物都表現(xiàn)出較好的清除 NaNO2及阻斷NDEA合成的作用，其中PR-01黑果桑醇提物抑制亞硝化作用最強(qiáng)。在濃度為0.8 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間60 min 時(shí)，PR-01黑果桑醇提物對(duì)NaNO2的清除率最高達(dá)92.25%，而對(duì)NDEA合成的阻斷率也最高，達(dá)87.25%，效果與Vc 相當(dāng)，有望作為后續(xù)防癌功能食品的開發(fā)資源。

還原性成分的種類、含量及其氧化還原特性是果蔬消除亞硝酸鹽能力的關(guān)鍵因素[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 11個(gè)桑椹試樣醇提物對(duì)NDEA合成的阻斷率均低于對(duì)亞硝酸鹽的清除率，其余4個(gè)則相反，與前人[23]報(bào)道的一致，這可能是由于不同抗氧化劑和二乙胺競(jìng)爭(zhēng)性與亞硝酸鹽反應(yīng)能力不同造成的。本試驗(yàn)以原花青素為基準(zhǔn)設(shè)置不同桑椹醇提物濃度，發(fā)現(xiàn)其清除亞硝酸鹽和阻斷NDEA合成的效果隨濃度的增加而提高，表明桑椹醇提物抑制亞硝化作用活性與其原花青素含量正相關(guān)。本試驗(yàn)相關(guān)性分析結(jié)果也顯示，各樣品桑椹醇提物對(duì)亞硝酸鹽清除率、對(duì)NDEA合成阻斷率與總黃酮、總酚含量呈一定的正相關(guān)，表明原花青素、多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)可能是桑椹醇提物發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。另外，多酚類、黃酮類成分不同、含有的酚羥基數(shù)量及位置不同都可能影響到其對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用。如AH-07黑果桑和野生蒙桑的醇提物原花青素含量相當(dāng)，總酚和總黃酮含量不同，其清除亞硝酸鹽活性亦有較大差別。因此，后續(xù)研究可進(jìn)一步對(duì)桑椹醇提物進(jìn)行色譜分離純化，進(jìn)一步探討原花青素、多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)的各單體結(jié)構(gòu)與其抑制亞硝化作用之間的關(guān)系。這也可能是各桑椹試樣醇提物對(duì)亞硝酸鹽的清除率與其總酚、總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)存在不同的原因

綜上所述，桑椹醇提物富含原花青素、總酚和總黃酮等活性物質(zhì)，在體外具有較好的清除亞硝酸鹽和阻斷NDEA合成的作用，15個(gè)桑椹試樣中PR-01黑果桑表現(xiàn)出最高的原花青素含量(155.41±3.34 mg/g)和總黃酮含量(3.05±0.11 mg/g)，其醇提物也具有最強(qiáng)的對(duì)亞硝酸鹽的清除率(92.40%)和對(duì)NDEA合成的阻斷率(87.25%)，若開發(fā)PR-01黑果桑桑椹醇提物為食品添加劑或防癌功能食品，將對(duì)預(yù)防相關(guān)癌癥具有重要的意義。