牦牛皮膠對(duì)環(huán)磷酰胺致貧血小鼠血象紅系參數(shù)及脾臟結(jié)構(gòu)的影響

陳 琦，楊紅霞，李 雁，王曉喜，魏立新，杜玉枝*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所 青海省藏藥藥理學(xué)與安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810000；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

貧血是一種紅細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致組織缺氧的疾病，全球25%的人受其困擾，而且在亞洲人群的發(fā)病率最高[1]，由于其周期長(zhǎng)，病情發(fā)展比較緩慢，沒(méi)有特異性的臨床癥狀，具有極大的隱藏性，對(duì)人們的身體健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，它對(duì)兒童的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致普通人群的疲勞和低生產(chǎn)力[2]。

牦牛作為高原特有的牛種，由牦牛的鮮皮經(jīng)一系列加工制成的皮膠含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[3]，已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)牦牛皮膠含有20.95%人體必須氨基酸及鈣、鈉、鎂、鉀等礦物質(zhì)元素[4]。而牛皮膠的功效早在《本草綱目》中就有記載——“主治吐血，衄血，下血，血淋，下痢，妊婦胎動(dòng)血下”，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)牦牛皮膠對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)性貧血有改善的作用[5]。由環(huán)磷酰胺造成的再生障礙性貧血小鼠模型[6]穩(wěn)定可靠，可作為進(jìn)一步觀察牦牛皮膠的補(bǔ)血功效的疾病模型。觀察牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠臟器系數(shù)、血象紅系參數(shù)及脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)等的影響，為探討牦牛皮膠的補(bǔ)血機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：17090125)；牦牛皮：購(gòu)自青海西寧友誼屠宰場(chǎng)；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；甲叉雙丙烯酰胺(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；過(guò)硫酸銨(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；TEMED(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；SDS(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；考馬斯亮藍(lán)G250(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；阿膠補(bǔ)血顆粒(東阿阿膠股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1711003)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠210只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，雌雄各半，所有小鼠在體質(zhì)量與周齡方面無(wú)明顯差異，具有可比性；購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SYXK(甘)2015-0001。

1.3 儀器

電泳儀(BIORAD公司，PowerPac)；垂直電泳槽(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Mini-PROTEAN Tetra)；凝膠成像儀(BIORAD公司，GelDoc 2000)；血液細(xì)胞分析儀(HORIBA公司，ABX Pentra XL80)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，AL105)；超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司，UPH-I-40L)；光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，BX41)；脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司，TSJ-Ⅲ)；包埋機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司，BMJ-Ⅲ)；切片機(jī)(Leica公司，RM2126)。

2 方法

2.1 供試藥物的制備

新鮮牦牛皮脫毛脫脂處理后，與蒸餾水以1:10(w/v)的比例，在80 ℃下連續(xù)加熱攪拌6 h，重復(fù)2次，將得到的明膠液體合并，加熱濃縮干燥得到牦牛皮膠干粉，其中每1 kg新鮮牦牛皮可得167 g牦牛皮膠干粉。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，用蒸餾水溶解牦牛皮膠干粉，分別配制成0.05、0.1、0.15、0.3 g/mL的牦牛皮膠溶液待用。

2.2 SDS-PAGE分析

依照Laemmli等[7]的方法，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，樣品上樣量為5 μL。恒壓電泳，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。電泳結(jié)束后進(jìn)行染色，脫色，最后用凝膠成像儀進(jìn)行成像。

2.3 動(dòng)物分組

SPF級(jí)小鼠210只，雌雄各半，隨機(jī)分成7組，按中藥學(xué)藥理學(xué)研究方法計(jì)算給藥劑量[8]，即空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組，牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組，牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組，阿膠補(bǔ)血顆粒14.05 g/(kg·d)給藥組，每組30只。

2.4 貧血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕8-10]

采用腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法建立貧血模型，除空白對(duì)照組外，其余各組經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，每日一次，連續(xù)4天?？瞻讓?duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。

2.5 給藥劑量與方法

于實(shí)驗(yàn)的第5天開(kāi)始給予受試藥物，分別為牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥，牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥，牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥，阿膠補(bǔ)血顆粒14.05 g/(kg·d)給藥；各給藥組分別連續(xù)給藥7、14、21天，分別于三個(gè)時(shí)間點(diǎn)末次給藥30 min后，每組各取10只進(jìn)行眼球后靜脈叢取血，血液細(xì)胞分析儀分析外周血象紅系參數(shù)；稱取體質(zhì)量，頸椎脫臼處死后，解剖取出脾臟和胸腺，剝離周圍脂肪組織、結(jié)締組織，并用濾紙吸去其表面附著的血液，使用精密電子天平稱取脾臟和胸腺的質(zhì)量，按臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量公式計(jì)算脾臟和胸腺系數(shù)；取小鼠脾臟，置于4%多聚甲醛中固定、再經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(約6 μm)、HE染色制作石蠟切片，顯微鏡下觀察脾臟組織結(jié)構(gòu)[11]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x ± s )表示，選用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷結(jié)果的顯著性，P﹤0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 牦牛皮膠的分子量分布

由于不同分子量的牦牛皮膠理化性質(zhì)[12]不同，因此對(duì)供試的牦牛皮膠進(jìn)行了SDS-PAGE分析，圖1結(jié)果顯示了牦牛皮明膠在10～180 kD的分子量范圍的SDS-PAGE圖譜，可看出被試藥物分子量分布廣泛，在17～180 kD的范圍內(nèi)均有分布。

圖1 牦牛皮明膠的SDS-PAGE圖譜 Fig.1 SDS-PAGE pattern of yak skin gelatin M.Molecular weight marker注：M.分子量標(biāo)記物；A.牦牛皮膠樣品。Note:A.gelatin extracted from the Yak skin.

3.2 牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠一般體征的影響

空白對(duì)照組小鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中皮毛光滑，飲食狀況良好，鼻唇顏色淡粉紅；造模的第三天起，除空白對(duì)照組外各組小鼠的進(jìn)食量減少，毛蓬豎而且少光澤，耳、眼、尾及四肢的顏色蒼白；給予牦牛皮膠和阿膠顆粒后各組小鼠的狀況均有改善，逐漸接近空白對(duì)照組。

3.3 牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠臟器系數(shù)的影響

表1結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組脾臟系數(shù)顯著升高(P<0.05)，提示小鼠在注射環(huán)磷酰胺后免疫抑制，脾臟代償性造血，脾臟體積增大[13]，因而脾臟系數(shù)增大，說(shuō)明造模成功。與模型組相比，給藥7天，牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組、2 g/(kg·d)給藥組、3 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)；給藥14天，牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)；給藥21天，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明各濃度牦牛皮膠均能減輕免疫抑制造成的脾臟代償性造血的狀況，且在給藥7天時(shí)效果最優(yōu)。

與空白對(duì)照組相比，模型組胸腺系數(shù)顯著降低(P<0.05)，提示各組小鼠胸腺萎縮，免疫功能下降，造模成功；與模型組相比，給藥7天，牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組胸腺系數(shù)均顯著升高(P<0.05)；給藥14天，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組胸腺系數(shù)均顯著升高(P<0.05)；給藥21天，牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組、 2 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組胸腺系數(shù)均顯著升高(P<0.05)，表明各組牦牛皮膠均能使得環(huán)磷酰胺造成的免疫功能降低的狀況好轉(zhuǎn)，且隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)效果越顯著。

表1 牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠臟器系數(shù)的影響

注：與空白組相比*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01;Compare with model,#P<0.05，##P<0.01.

3.4 牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠外周血象紅系參數(shù)的影響

表2及表3結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明環(huán)磷酰胺造模使小鼠的造血功能抑制，模型建立成功。

與模型組相比，給藥7天，1 g/(kg·d)給藥組，血紅蛋白、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，2 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，6 g/(kg·d)給藥組，平均血紅蛋白量顯著升高(P<0.01)，阿膠補(bǔ)血顆粒組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.01)；給藥14 d，1 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容及平均血紅蛋白量顯著升高(P<0.05)，2 g/(kg·d)給藥組和3 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，6 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，阿膠補(bǔ)血顆粒組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)；給藥21 d，1 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及紅細(xì)胞比容顯著升高(P<0.05)，2 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，3 g /(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，6 g/(kg·d)給藥組，平均血紅蛋白量顯著升高(P<0.05)，阿膠補(bǔ)血顆粒組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)。各給藥組的血象紅系參數(shù)相對(duì)模型組均有提高，其中以1 g/(kg·d)給藥組的效果最明顯，且在給藥14天各給藥組作用明顯。

表2 牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠血象紅系參數(shù)的影響

注：與空白組相比*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01;Compare with model,#P<0.05，##P<0.01.

表3 牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠血象紅系參數(shù)的影響

續(xù)表3(Continued Tab.3)

組別Group平均血紅蛋白量MCH (pg)平均血紅蛋白濃度MCHC (g/L)7 d14 d21 d7 d14 d21 d1 g/(kg·d)給藥組1 g/(kg·d) medicated group15.38±0.51##15.27±0.60##14.70±0.23284.22±5.64##278.75±5.18283.00±8.102 g/(kg·d)給藥組2 g/(kg·d) medicated group15.49±0.50##15.45±0.78##15.16±0.48#279.25±9.69##285.75±4.83##287.00±10.38#牦牛皮膠給藥組Medicated group of yak skin gelatin3 g/(kg·d)給藥組3 g/(kg·d) medicated group14.78±0.9815.11±0.56#14.97±0.70270.50±7.45289.75±10.79##288.86±8.78#6 g/(kg·d)給藥組6 g/(kg·d)medicated group15.11±0.58##15.06±0.66#15.17±0.54#273.57±15.23285.00±9.01##281.17±11.43阿膠補(bǔ)血顆粒組Lvjiaobuxue granules group15.78±0.69##15.01±0.51#15.64±2.95#293.64±4.55##282.67±14.28#279.27±15.29

注：與空白組相比*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01;Compare with model,#P<0.05，##P<0.01.

3.5 牦牛皮膠對(duì)貧血小鼠脾臟結(jié)構(gòu)的影響

圖2和圖3結(jié)果顯示，空白對(duì)照組紅髓、白髓界限清楚，脾索內(nèi)有豐富的淋巴細(xì)胞，有較多的脾小體，脾竇無(wú)充血；模型組紅髓白髓界限不清，淋巴細(xì)胞數(shù)目和脾小體減少，脾竇充血；給藥14天，各給藥組可見(jiàn)白髓中淋巴細(xì)胞密集，巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞明顯增多，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血；給藥21天，各給藥組可見(jiàn)較多的淋巴細(xì)胞，白髓與紅髓的界限變清晰。

圖2 貧血小鼠給藥14天脾臟HE染色結(jié)果(400×) Fig.2 Results of HE staining of mice with cyclophosphamide-induced anemia for 14 days (400×) 注：A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組；D.牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組；E.牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組；F.牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組。Note:A.Control group;B.Model group;C.1 g/(kg·d) medicated group;D.2 g/(kg·d) medicated group;E.3 g/(kg·d) medicated group；F.6 g/(kg·d) medicated group.

4 討論

現(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)動(dòng)物皮膠有滋陰補(bǔ)血的功效[14]，牦牛皮膠由于它豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，已經(jīng)作為生物制品用于臨床，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)環(huán)磷酰胺所致的貧血小鼠的血象紅系參數(shù)、臟器系數(shù)和脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究了牦牛皮膠的補(bǔ)血作用。

圖3 貧血小鼠給藥21天脾臟HE染色結(jié)果(400×)Fig.3 Results of HE staining of mice with cyclophosphamide-induced anemia for 21 days (400×) 注：A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組；D.牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組；E.牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組；F.牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組。Note:A.Control group;B.Model group;C.1 g/(kg·d) medicated group;D.2 g/(kg·d) medicated group;E.3 g/(kg·d) medicated group；F.6 g/(kg·d) medicated group.

環(huán)磷酰胺作為一種細(xì)胞烷化劑，對(duì)骨髓細(xì)胞有損傷的作用，引起骨髓造血功能降低，進(jìn)而導(dǎo)致血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等功能成分的降低，造成貧血，同時(shí)，環(huán)磷酰胺也是一種免疫抑制劑，對(duì)機(jī)體的免疫器官有損傷的作用[15,16]；本研究的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著環(huán)磷酰胺給藥時(shí)間的增加，小鼠精神萎靡，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)脫落且沒(méi)有光澤，進(jìn)食減少，體重下降，脾臟系數(shù)增高，胸腺系數(shù)下降，血象紅系參數(shù)中紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度均顯著降低，脾臟的正常組織形態(tài)被破壞，脾淋巴細(xì)胞減少，所有特征符合環(huán)磷酰胺致貧血模型的動(dòng)物特征。

胸腺和脾臟作為重要的免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、發(fā)育和成熟的場(chǎng)所，其系數(shù)的變化能體現(xiàn)機(jī)體免疫機(jī)能的變化[17]，給藥組小鼠胸腺系數(shù)的升高提示牦牛皮膠能逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺造成的胸腺萎縮的情況，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能；同時(shí)由于免疫抑制的原因，骨髓造血功能受損，脾臟代償性髓外造血[18,19]，使脾臟的體積增大，脾臟系數(shù)升高，牦牛皮膠給藥后，脾臟系數(shù)的降低說(shuō)明骨髓造血的功能有一定程度恢復(fù)，脾臟的代償性造血減少。其中除牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組外各給藥組在給藥7天時(shí)均能顯著降低胸腺系數(shù)，提示牦牛皮膠給藥短期內(nèi)能刺激小鼠的骨髓造血，減弱脾臟代償性造血。而隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組與空白組差異逐漸減小，說(shuō)明停用環(huán)磷酰胺后小鼠的骨髓造血自行開(kāi)始恢復(fù)；給藥組與模型組差異逐漸變小，提示給藥周期延長(zhǎng)后骨髓造血的恢復(fù)同小鼠自然恢復(fù)沒(méi)有差別。除牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組外，其余各給藥組在給藥21天時(shí)均能顯著降低胸腺系數(shù)，提示牦牛皮膠增強(qiáng)免疫功能的作用需要較長(zhǎng)的給藥時(shí)間，而隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組與空白組差異逐漸減小，說(shuō)明停用環(huán)磷酰胺后小鼠的免疫功能開(kāi)始恢復(fù)，給藥組與空白組差異逐漸減小，提示牦牛皮膠給藥時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)能協(xié)同機(jī)體自然恢復(fù)增強(qiáng)免疫功能直至正常。其中牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組既能恢復(fù)免疫功能又能增強(qiáng)骨髓造血功能。

牦牛皮膠給藥后，各給藥組紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度均有升高；隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組與空白組差異減小，但仍有差異，說(shuō)明停用環(huán)磷酰胺后小鼠造血功能逐漸自然恢復(fù)，給藥組與空白組差異逐漸減小，說(shuō)明隨著牦牛皮膠給藥時(shí)間延長(zhǎng)機(jī)體的造血功能也在逐步恢復(fù)；其中給藥14天時(shí)提高貧血小鼠血象紅系參數(shù)效果顯著，提示給藥14天補(bǔ)血效果最佳，可拮抗環(huán)磷酰胺的骨髓抑制功能。其中牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組在給藥7、14、21天時(shí)均能升高各血象紅系參數(shù)，說(shuō)明該濃度牦牛皮膠補(bǔ)血效果好且持久。

各組貧血小鼠給藥后脾臟組織形態(tài)逐漸恢復(fù)，紅髓和白髓的界限逐漸清晰，脾淋巴細(xì)胞增多，同時(shí)三個(gè)不同給藥濃度組隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)均逐漸趨近正常，和脾臟系數(shù)結(jié)果相吻合，都提示牦牛皮膠恢復(fù)了機(jī)體的免疫功能。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)體系復(fù)雜，本研究觀察了牦牛皮膠在治療貧血過(guò)程中，對(duì)機(jī)體的脾臟及血象紅系參數(shù)的指標(biāo)影響，其結(jié)果可為進(jìn)一步研究其對(duì)免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的作用機(jī)制和作用方式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。