水稻條斑病抗感品種根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能分析

楊俊, 王星, 付麗娜, 汪婭婷, 劉棋, 苗新利, 王凡, 魏蘭芳, 姬廣海*

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水稻條斑病抗感品種根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能分析

楊俊1, 王星1, 付麗娜1, 汪婭婷1, 劉棋1, 苗新利3, 王凡1, 魏蘭芳2, 姬廣海1*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 昆明 650201 3. 云南省楚雄師范學(xué)院數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院，楚雄 675000

通過(guò)抗感水稻細(xì)菌性條斑病(簡(jiǎn)稱細(xì)條病)的品種的水根際可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和代謝功能多樣性分析, 探討其根際細(xì)菌多樣性差異與水稻抗細(xì)條病的相關(guān)性。采集孕穗期水稻品種CG2和IR24的植株根際土壤, 采用多種培養(yǎng)基進(jìn)行可培養(yǎng)細(xì)菌的分離、鑒定, 并通過(guò) 16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹; 利用Biolog 技術(shù)分析不同品種根際微生物的代謝功能差異。結(jié)果顯示: 不同水稻品種的根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌分析發(fā)現(xiàn)抗病品種CG2以芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群, 而感病品種IR24以節(jié)桿菌為優(yōu)勢(shì)種群; 對(duì)條斑病菌有抑制的菌株, 篩選后以芽孢桿菌為主, 且抗病品種的比率達(dá)47%以上, 而感病材料中只有2.3%; 抗病品種根際微生物群落的Shannon多樣性指數(shù)(H′), Shannon均勻度指數(shù)(SE), Simpson指數(shù)(D), McIntos指數(shù)(U)和McIntosh均勻度指數(shù)(ME)分別增加了8.80%, 48.49%, 11.76%, 41.88%和0.52%; 主成份分析表明抗病品種CG2的根際土壤微生物與感病品種IR24相比, 對(duì)碳水化合物, 氨基酸類、酯類、醇類、胺類和酸類的利用率分別提高了12.52%、66.53%、3.78%、7.49%、27.98%和40.67%。研究表明, 從根際土壤細(xì)菌數(shù)量和種類上看, 抗病品種CG2的根際土壤細(xì)菌數(shù)量和種類與感病品種相比, 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性更為豐富, 發(fā)揮生防作用的菌群更多, 為水稻條斑病的生物防治提供了思路和資源。

水稻條斑病; 根際微生物; 群落結(jié)構(gòu); 代謝功能

0 前言

水稻是世界上重要的糧食作物, 尤其是在亞洲。水稻細(xì)菌性條斑病是由水稻黃單胞屬()細(xì)菌通過(guò)氣孔或者傷口入侵寄主植物, 定殖于水稻葉片的薄壁組織細(xì)胞間并擴(kuò)展形成病斑, 病斑不斷融聚導(dǎo)致全葉枯死。近年來(lái), 隨著農(nóng)業(yè)種植環(huán)境的改變, 水稻細(xì)菌性條斑病形成的危害越來(lái)越嚴(yán)重, 在中國(guó)條斑病引起的水稻減產(chǎn)已經(jīng)從10%—20%發(fā)展到減產(chǎn)40%[1]。

植物內(nèi)生菌是生存于寄主植物組織中, 與宿主植物建立了共生或互生關(guān)系并對(duì)植物不造成傷害的一類微生物[2]。植物內(nèi)生菌可以促進(jìn)宿主的生長(zhǎng), 增加宿主的抗病、抗逆性, 其種群組成與寄主種類、定殖部位、寄住的生長(zhǎng)狀況及生長(zhǎng)環(huán)境等相關(guān)[3]。根際細(xì)菌是從根際分離所得, 有研究報(bào)道內(nèi)生細(xì)菌來(lái)源于根際, 并從根際進(jìn)入植物組織內(nèi)部, 有益的根際細(xì)菌還能促進(jìn)植物的能量代謝, 提高寄主的抗病、逆性和合成促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素[4-5]。由此證明, 植物內(nèi)生細(xì)菌與根際細(xì)菌具有一定的功能相關(guān)性[6-7]。植物根際微生物的種群結(jié)構(gòu)[8-9]和代謝功能特異性對(duì)植物寄住的生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗脅迫的影響[10-12], 根際微生物的種群結(jié)構(gòu)和代謝功能的差異對(duì)作物的抗病性在棉花、煙草、西瓜和大豆上有所報(bào)道。李連洪等對(duì)棉花抗黃萎病品種(春矮早和86-6)和感病品種(中棉17和豫棉12)的根際真菌區(qū)系進(jìn)行了分析, 結(jié)果表明抗病品種根際微生物的群落結(jié)構(gòu)比感病品種更為復(fù)雜, 對(duì)枯萎病菌具有抑制作用的真菌種數(shù)和比率都高于感病品種, 而且抗病品種根際真菌的優(yōu)勢(shì)種對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用較強(qiáng)[13]。蔡秋華等對(duì)青枯病和黑脛病不同抗性烤煙品種‘紅花大金元’、‘云煙-87’和‘K326’的群落結(jié)構(gòu)和代謝功能多樣性進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)烤煙根際可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌數(shù)量和微生物總量皆與品種抗性呈正相關(guān), 而真菌數(shù)量與品種抗性基本呈負(fù)相關(guān)[14]。雷娟利等發(fā)現(xiàn)西瓜抗枯萎病性與根際細(xì)菌的數(shù)量具有相關(guān)性,在生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段, 無(wú)論是土培還是基質(zhì)培養(yǎng)均表現(xiàn)為: 抗病材料的根際細(xì)菌數(shù)量高于感病材料, 且根際真菌與放線菌數(shù)量與西瓜的抗感枯萎病性沒(méi)有相關(guān)性[15]。陳宏宇等發(fā)現(xiàn)對(duì)大豆根腐病抗病性不同的大豆品種根際可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)存在差異, 抗根腐病品種S10根面可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著高于感病品種H25[16]。

目前關(guān)于水稻細(xì)菌病害的生物防治的資源發(fā)掘主要集中于水稻內(nèi)生菌和根際微生物, 很多研究從水稻的葉片、莖內(nèi)生菌和根際微生物發(fā)掘出很多對(duì)病害具有生防價(jià)值的菌株[17-18], 但針對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病不同抗性水平的水稻品種根際細(xì)菌的微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能差異進(jìn)行研究的報(bào)道鮮有。本研究前期通過(guò)抗性篩選得到一個(gè)對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病具有高抗水平的水稻秈稻地方品種CG2, IR24作為感病對(duì)照品種, 通過(guò)對(duì)水稻抗感品種的根際可培養(yǎng)細(xì)菌的分離、鑒定、群落多樣性和代謝多樣性的差異。對(duì)闡述水稻品種、根際有益細(xì)菌、病原細(xì)菌和環(huán)境之間的相互關(guān)系有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí), 也為抗水稻細(xì)菌性病生物資源的挖掘提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 水稻材料

水稻種植于云南省德宏傣族景頗族自治州芒市芒核村水稻實(shí)驗(yàn)田(經(jīng)緯度N24°25′57′′, E98°32′55′′, 海拔: 837 m), 試驗(yàn)田采用小區(qū)設(shè)計(jì), 共6個(gè)小區(qū)(每個(gè)品種各三個(gè)小區(qū), 按照單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)), 每個(gè)小區(qū)為單一水稻品種, 小區(qū)內(nèi)水稻種植呈3行10列, 行間距25 cm, 列寬20 cm。移栽時(shí)間為2017年5月15日。

2.2 土樣采集

采集時(shí)間為2017年6月29日, 水稻處于孕穗期, 每個(gè)小區(qū)采用五點(diǎn)采樣法。采集時(shí)掘取整株水稻, 水稻根部土壤掘取至少15 cm的深度, 保持整個(gè)根系的完整, 輕輕抖落根系表面的大塊土壤 ,收集附著在根系上的土壤作為根際土壤, 采集后立即將水稻帶回實(shí)驗(yàn)后收集根際土壤, 水稻“CG2”品種根際土壤編號(hào)為“CG2”, 水稻“IR24”品種根際土壤編號(hào)為“IR”, 收集完成存于4 ℃[19]。

2.3 水稻根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌分離

將10 g水稻根際土加入到含90 mL無(wú)菌水三角瓶中, 150 r·min-1、28 ℃搖床條件下放置15 min后采用梯度稀釋3次后, 將10-1、10-2、10-3梯度涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[20], 28 ℃培養(yǎng)24—48 h。待單菌落長(zhǎng)出, 進(jìn)行平板計(jì)數(shù)后保存于25%甘油的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中。

2.4 根際土壤細(xì)菌16S rRNA 鑒定

采用LB平板復(fù)壯保存的單菌落后, 轉(zhuǎn)接至液體LB培養(yǎng)基(不含瓊脂)中, 160 r/min, 28 ℃培養(yǎng)12 h后, 采用細(xì)DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取, 擴(kuò)增引物為27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’; 1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3’。PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃ 4 min(預(yù)變性); 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min; 4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI NBLAST 進(jìn)行相似性比對(duì), 選取同源性比較高的典型菌株的16S rRNA基因序列作為參比對(duì)象, 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 并以屬進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。

2.5 水稻根際土壤細(xì)菌對(duì)條斑病的抑制作用分析

采用平板對(duì)峙法篩選對(duì)條斑病病原菌具有抑制作用的根際土壤細(xì)菌: 在滅菌培養(yǎng)皿中加入濃度為3×108cfu·mL-1的菌懸液 100 μL, 再加入 20 mL 培養(yǎng)基, 無(wú)菌操作臺(tái)晾干后, 在平板中心用無(wú)菌牙簽接種已培養(yǎng)24 h的根際土壤細(xì)菌, 每個(gè)菌三個(gè)重復(fù), 28 ℃培養(yǎng), 48 h后觀察結(jié)果, 并測(cè)量抑菌圈直徑。條斑病菌選用本實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行致病性測(cè)定和基因組測(cè)序的菌株YM15。

2.6 根際土壤微生物活性測(cè)定及其數(shù)據(jù)分析

根際微生物代謝功能多樣性采用Biolog-ECO (31 種碳源)進(jìn)行分析測(cè)定。Biolog ECO微平板中具有6 類碳源, 共31 種, 各孔碳源包括糖類10 種, 氨基酸類6 種, 羧酸類 7 種, 多聚物類 4 種, 酚酸類 2 種, 胺類化合物 2 種, 酚類2種。

稱取10.0 g土壤加入90 mL無(wú)菌生理鹽水(0.85%)溶液中, 在搖床上振蕩30 min, 4 ℃冰箱靜置10 min, 待分層穩(wěn)定取上清液梯度稀釋10-3, 取150 μL稀釋液至 Biolog-ECO 板的微孔中, 接種好的平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng), 分別于24、48、72、96、120、144、168 h在Biolog EmaxTM 自動(dòng)讀盤機(jī)上用 Biolog Reader 4.2軟件(Biolog, Hayward, CA, USA)讀取 OD590 nm值[20]. 采用培養(yǎng) 72 h 的數(shù)據(jù)進(jìn)行土壤微生物碳源利用分析和主成分分析, 微生物多樣性指數(shù)分析采用EXCEL2010, 根際微生物群落的Shannon多樣性指數(shù)(H′)Shannon均勻度指數(shù)(SE), Simpson指數(shù)(D), McIntos指數(shù)(U)和McIntosh均勻度指數(shù)(ME)的計(jì)算方法見(表1)[21], 其中Pi為第i孔的相對(duì)吸光值(C-R)與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率; S為顏色變化的孔的數(shù)目; ni是第i孔的相對(duì)吸光值(C-R); N是相對(duì)吸光值總和。采用軟件PAST進(jìn)行主成份分析, 各碳源利用情況的熱力圖使用MetaboAnalyst 3.0 在線生成,其中聚類方法中樣本歸類距離為歐氏距離 Euclidean。

3 結(jié)果與分析

3.1 水稻根際可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定

首先通過(guò)對(duì)培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)平板進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù), 將分離保存的98株菌進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增測(cè)序, 經(jīng)過(guò)NCBI同源性比較與相似性達(dá)到99%～100%的菌株確定為同一分類學(xué)地位, 剔除重復(fù)重復(fù)序列菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。經(jīng)分析89株細(xì)菌集中在以下19個(gè)屬, 并且兩個(gè)水稻品種的根際細(xì)菌

表1 微生物群落多樣性指數(shù)計(jì)算方法

CG2代表CG2品種的根際可培養(yǎng)細(xì)菌, IR24代表IR24品種的根際可培養(yǎng)細(xì)菌。

Figure 1 Phylogenetic tree was constructed based on the 16S rRNA gene sequences showing the evolutionary relationships of rice rhizosphere bacteria CG2

3.2 水稻根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌拮抗細(xì)菌的篩選

上述鑒定得到的單菌落對(duì)水稻條斑病病原菌YM15進(jìn)行抑菌測(cè)定, 8株菌對(duì)條斑病病原菌YM15具有明顯的抑菌作用, 6株來(lái)源于CG2, 2株來(lái)源于IR24, 除菌株F為Microbacterium屬, 其他有抑菌作用的全為Bacillus屬,其中菌株A、C、D、和H的抑菌效果較強(qiáng), (表3)。

表2 不同水稻品種根際土壤細(xì)菌的屬間差異

表3 生防菌對(duì)水稻條斑病原菌的拮抗效果測(cè)定

3.3 不同品種水稻根際細(xì)菌對(duì)總碳源的利用情況

平均顏色變化率(AWCD)是反映土壤微生物活性的重要指標(biāo)。兩個(gè)不同抗性品種的根際微生物群落的AWCD值在24 h以前均變化不明顯; 在24 h—120 h之間變化明顯, AWCD值急劇升高; 120 h后, AWCD值趨于平緩達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的各個(gè)階段, 水稻品種CG2的AWCD值均高于水稻品種IR24, 以培養(yǎng)96 h時(shí)AWCD值來(lái)比較, 抗病品種CG2比感病品種IR24提高了36%(F=2.28270, P>0.05), 這表明抗病品種CG2的根系微生物的對(duì)測(cè)試底物的利用能力高于感病品種IR24(圖2)。

3.4 不同品種對(duì)根際微生物多樣性指數(shù)的影響

不同的多樣性指數(shù)可以表示土壤微生物群落利用碳源類型的情況。Shannon多樣性指數(shù)評(píng)估豐富度和均度; Simpson評(píng)估某些最常見種的優(yōu)勢(shì)度指數(shù); McIntosh指數(shù)基于群落物種多維空間上的Euclidian距離的多樣性指數(shù), 由McIntosh指數(shù)計(jì)算得出的均勻度對(duì)培養(yǎng) 96 h 各處理土壤進(jìn)行測(cè)定, 計(jì)算各品種根際微生物代謝功能多樣性指數(shù)。由表 4 可知, 在培養(yǎng) 72 h 后,水稻抗病品種CG2的根際微生物代謝功能多樣性和感病品種IR24相比,抗病品種根際微生物群落的Shannon多樣性指數(shù)(H′)Shannon均勻度指數(shù)(SE), Simpson指數(shù)(D), McIntos指數(shù)(U)和McIntosh均勻度指數(shù)(ME)分別增加了8.80%(F= 1.766 P-value=0.255), 48.49%(F=3.472 P-value=0.136), 11.76%(F=0.762 P-value=0.432), 41.88%(F=3.689 P- value=0.127)和0.52%(F=0.001 P-value=0.994)。

3.5 不同品種根際微生物對(duì)不同類型碳源利用的差異

如圖 3所示, 抗條斑病品種CG2的三個(gè)小區(qū)根際土壤微生物利用碳源的效率聚為同一類, 同樣的感條斑病品種IR24的三個(gè)小區(qū)根際土壤微利用碳源的效率聚為同一類。數(shù)據(jù)分析表明, 抗條斑病品種CG2的根際土壤微生物與感病品種IR24相比, 對(duì)碳水化合物, 氨基酸類, 酯類, 醇類, 胺類和酸類的利用率分別提高了12.52%, 66.53%, 3.78%, 7.49%, 27.98%, 和40.67%。

圖2 不同細(xì)菌性條斑病抗性水稻品種根際土壤微生物平均顏色隨時(shí)間的變化率

Figure 2 Average well color development (AWCD) changes with incubation time of different resistance rice cultivars

表4 水稻抗感品種根際土壤微生物群落代謝功能多樣性指數(shù)

注: 同列數(shù)據(jù)后不同字母分別代表兩個(gè)品種在 p<0.05 水平下差異顯著

B1: 丙酮酸甲酯; C1: 吐溫 40; D1: 吐溫 80; E1: α-環(huán)式糊精; F1: 肝糖; G1: D-纖維二糖; H1: α-D-乳糖; A2: β-甲基-D-葡萄糖苷;B2: D-木糖; C2: i-赤蘚糖醇; D2: D-甘露醇; E2: N-乙?；?D-葡萄糖胺; F2: D-葡萄糖胺酸; G2: 葡萄糖-1-磷酸鹽; H2: D,L-α-甘油磷酸鹽; A3: D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯; B3: D-半乳糖醛酸; C3: 2-羥基苯甲酸; D3: 4-羥基苯甲酸; E3: γ-羥基丁酸; F3: 衣康酸; G3: α-丁酮酸; H3:D-蘋果酸; A4: L-精氨酸; B4: L-天冬酰胺酸; C4: L-苯基丙氨酸; D4: L-絲氨酸; E4: L-蘇氨酸; F4: 葡萄糖-L-谷氨酸; G4: 苯基乙胺; H4:腐胺。CG1~3 分別代表品種CG2的 3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)小區(qū), IR1~3 分別代表品種IR24的3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)小區(qū)。

Figure 3 Utilization of 31 sole carbon sources by microorganisms in rhizosphere soils of different resistant rice variety

以培養(yǎng)96 h的測(cè)定數(shù)據(jù)為依據(jù)進(jìn)行主成分分析。水稻抗病品種CG2根際土壤微生物主成分PC1的變異為 83.7%,主成分 PC2 的變異為 10.9%,兩主成分的總貢獻(xiàn)率為94.6%, 其余的主成份由于貢獻(xiàn)率較小不做分析, 因此主成分PC1和主成分PC2能反映明顯的差異。兩個(gè)品種在PC1軸上被較好的分離開,CG2的主要集中于第一、四象限, 相對(duì)應(yīng)的IR24的主要集中于二、三象限(圖4)。結(jié)果說(shuō)不同抗性水平的水稻品種根際土壤微生物的群落對(duì)碳源的利用能力不同, 說(shuō)明兩個(gè)品種的群落結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有明顯的差異。某一碳源的初始載荷因子決定了該碳源對(duì)主成份的影響, 初始載荷因子越大, 則影響越大。根據(jù)Choi建立的選擇標(biāo)準(zhǔn), 在主成份1和主成份2上絕對(duì)值大于0.18的載荷因子碳源對(duì)主成份有較大影響[22]。

3.6 不同水稻品種根際土壤微生物碳源利用特征的主成份分析

對(duì)主成分1影響較大的碳源有10種, 2種為碳水化合物: a-環(huán)式糊精(E1),葡萄糖-1-磷酸鹽(G2); 3種為羧酸類: 2-羥苯甲酸(C3), γ-羥基丁酸(E3), 衣康酸(F3); 3種為氨基酸類: L-苯基丙氨酸(C4), L-蘇氨酸(E4), 甘氨酰-L-谷氨酸(F4); 1中為胺類: 腐胺(H4); 1種為醇類: D,L-a-甘油(H2)。10種碳源全部為正相關(guān)。

對(duì)主成份2影響較大的碳源有4種, 1種碳水化合物: a-D-乳糖(H1)呈正相關(guān); 2種羧酸類: 2-羥苯甲酸(C3)呈負(fù)相關(guān), γ-羥基丁酸(E3)呈負(fù)相關(guān); 1種胺類: 苯乙基胺(G4)呈正相關(guān)(表5)。

4 討論

土壤是植物賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ), 土壤中的微生物對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著直接關(guān)系。不同的植物品種和不同土壤性質(zhì)中的微生物的群落結(jié)構(gòu)有著很大的差異。林文雄等基于基因組總DNA 的T-RFLP 分析旱直播模式下5 葉期和7 葉期化感水稻根際土壤微生物的組成和結(jié)構(gòu)具有差異性, 表明水稻根際微生物受水稻品種和生理期的影響[23]。潘麗媛等對(duì)高產(chǎn)示范田和常規(guī)水稻田的同一水稻品種的微生物數(shù)量進(jìn)行比較, 高產(chǎn)示范田水稻根際微生物數(shù)量是常規(guī)水稻田的2倍多, 說(shuō)明水稻根際微生物越豐富, 水稻越高產(chǎn); 并且得出細(xì)菌絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群, 放線菌, 真菌只占微生物總數(shù)的0.16%, 由此證明細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)對(duì)水稻高產(chǎn)起著重要作用[24]。本研究結(jié)果顯示, 水稻條斑病抗性差異品種之間的水稻根際微生物的多樣性存在著差異, 且抗病品種的多樣性和感病品種相比均有增加。

近年來(lái)通過(guò)研究植物的內(nèi)生菌和根際微生物與寄主植物互作增加植物對(duì)病原菌抗性的研究已有報(bào)道, Yanti對(duì)大蔥的根際微生物進(jìn)行分離鑒定, 得到一株粘質(zhì)沙雷氏菌介導(dǎo)了大蔥對(duì)大蔥葉斑病()抗性[25]。Ke對(duì)198株根際微生物細(xì)菌生物防治不同的植物病害菌進(jìn)行篩選, 得到28株具有廣譜抗性的根際微生物細(xì)菌對(duì)四種不同的病原菌引起的植物病害,()引起的番茄瘡痂病(bacterial spot of tomato),()引起的番茄斑點(diǎn)病(bacterial speck of tomato)[26]。本研究從, ()引起的水稻細(xì)菌性條斑病(rice leaf streak)作為出發(fā)點(diǎn)對(duì)水稻抗感品種根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌具有生防能力細(xì)菌的種類和數(shù)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 抗病品種“CG2”分離得到克雷伯菌屬(), 新鞘氨醇桿菌屬()和鏈霉菌屬()菌, 而在感病品種根際土中并未分離得到, 這三個(gè)菌屬在以往的研究中多報(bào)道為具有生防潛力的有益菌[27–29], 是否是這些菌屬的存在對(duì)水稻的抗性有影響需要更深入的研究; 對(duì)兩個(gè)品種中“CG2”水稻根際土壤細(xì)菌中對(duì)具有抑菌作用的主要菌屬為芽孢桿菌屬, 從篩選的結(jié)構(gòu)來(lái)看, 抗病品種根際土壤可培養(yǎng)生防菌數(shù)量比感病品種多, 對(duì)抗病品種的抗病是否起到作用及作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

圖4 不同抗性水稻根際微生物碳源利用特征的主成分分析

Figure 4 Principal components analysis of carbon utilization profiles in different resistance rice rhizosphere microbial community

表 5 抗條斑病水稻品種與感病品種根際土壤微生物對(duì) 31 種碳源利用在主成份1、主成份2 上的載荷(Loading>0.18 和 Loading<-0.18)

5 結(jié)論

本研究以水稻抗水稻細(xì)菌性條斑病抗性差異品種的根際土壤微生物作為研究對(duì)象, 對(duì)根際土壤中可培養(yǎng)的細(xì)菌分離和分子生物學(xué)鑒定, 利用采用平板對(duì)峙法篩選對(duì)具有抑制作用的生防菌, 平板計(jì)數(shù)法明確抗感水稻品種根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu), 結(jié)合Biolog ECO微生物多樣性分析系統(tǒng)對(duì)抗感水稻品種的代謝功能差異經(jīng)行分析, 最后得出以下結(jié)論:

水稻抗感細(xì)菌性條斑病品種的根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在很大的差異, 抗病品種CG2的細(xì)菌屬中作為生防菌的居多, 且直接有抑菌作用的菌株數(shù)量也更多; 從根際土壤微生物生代謝多樣性分析, 抗病品種CG2的各種多樣性指數(shù)葉高于感病品種CG2。這不僅為水稻細(xì)菌性條斑病的生物防治提供了思路和資源, 也為植物、根際微生物與病原微生物之間互作關(guān)系提供理論基礎(chǔ), 能更好的利用生態(tài)多樣性對(duì)病害進(jìn)行控制。

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Study on rhizosphere microbial community and functional diversity of different resistant rice varieties to rice leaf streak disease

YANG Jun1, WANG Xing1, FU Li-na1, LIU Qi1, MIAO Xinli3, WANG Fang1, WEI Lanfang2, JI Guanghai1*

1. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China 2. Experimental Agricultural Center, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China 3. School of Mathematics and Statistics，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000, China

We analyzed the rice rhizosphere microbiome composition and metabolism of different resistance rice cultivars, to explore the relationship between the rhizosphere soil microbial diversity and resistance to rice bacterial leaf streak. We collected the rhizosphere soil of plants CG2 and IR24 rice varieties in booting stage, using a variety of culture medium to cultivate bacteria isolation, purification, counting, and through the 16S rRNA homology comparison and phylogenetic tree analysis, and microbial metabolic function difference was studied by using Biolog. The results showed that 1057 single colony different varieties were isolated from the culture medium, andthey were divided into 15 types, 6 genera:,,,,,. Plate count in rhizosphere soil of different rice varieties of culturable bacteria showed bacillus was the dominant species in resistance cultivar CG2 and Arthrobacter was dominant species in the susceptible cultivar IR24. Shannon diversity index () and Shannon evenness index (), Simpson index (), McIntos index () and McIntosh evenness index () of the rhizosphere microbial community of resistance cultivar CG2 were increased by 8.80%, 48.49%, 11.76%, 41.88% and 0.52%, as compared to the susceptible cultivar IR24.The principal component analysis showed that the use of carbohydrates, amino acids, esters, alcohols, amine and acid were increasedby 12.52%, 66.53%, 3.78%, 7.49%, 27.98%, and 40.67% for the resistance cultivar CG2 rhizosphere soil microorganisms as compared with susceptible variety IR24. The research shows that the colony number and kind of the resistant cultivars CG2 rhizosphere soil bacteria are more than the susceptible cultivars IR24. The bacterial diversity is more abundant; the community structure is more stable; niche competition is stronger than pathogenic bacteria. The results can provide ideas and resources for the biological control of rice bacterial leaf streak.

rice leaf streak; rhizosphere microbial; community structure; metabolic function

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.01.003

X172

A

1008-8873(2019)01-017-09

2018-01-08;

2018-03-20

云南省科技廳農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目(2017FG001-005); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFD0200308); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (2018YFD0200703); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFC1702502); 國(guó)家自然基金(31460458).

楊俊( 1989—), 男, 云南楚雄人, 博士研究生, 從事植物微生物互作研究。729747016@qq.com

姬廣海, 男, 博士, 教授,主要從事農(nóng)業(yè)微生物微生物生態(tài)學(xué)研究 E-mail: jghai001@aliyun.com

楊俊, 王星, 付麗娜, 等. 水稻條斑病抗感品種根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能分析[J]. 生態(tài)科學(xué), 2019, 38(1): 17-25.

YANG Jun,WANG Xing, FU Li-na, et al. Study on rhizosphere microbial community and functional diversity of different resistant rice varieties to rice leaf streak disease[J]. Ecological Science, 2019, 38(1): 17-25.