SCN5A 基因多態(tài)性與糖尿病心臟病變患者左室功能的關(guān)系

王可 閆鵬 張恒亮 趙希坤 趙飛龍 王騰飛 董平栓

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，心血管內(nèi)科重癥病區(qū)（河南洛陽(yáng)471000）

糖尿病心臟病變是指糖尿病患者因血糖、血脂等代謝紊亂進(jìn)一步引起的心臟微血管、大血管以及心肌組織、植物神經(jīng)紊亂等病變，為糖尿病較為常見的并發(fā)癥之一［1］，其有著較高的致殘致死率，研究發(fā)現(xiàn)約有70%～80%的糖尿病患者最終死于心血管并發(fā)癥［2］。SCN5A 基因編碼Na+通道的成孔亞單位，在控制心肌細(xì)胞的興奮傳導(dǎo)以及興奮維持方面起著重要作用。研究顯示［3?4］，SCN5A 基因的一些常見單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與心臟疾病（如心臟性猝死、單純性先天性心臟病、病態(tài)竇房結(jié)綜合征等）有關(guān)。目前研究的與心臟病變有關(guān)的SCN5A 的多態(tài)位點(diǎn)有H55R、P1090L、D1819D、C5457T 等［5］，但目前對(duì)于SCN5A 基因多態(tài)性與糖尿病心臟病變的關(guān)系研究報(bào)道相對(duì)較少，本研究旨在探討SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)與糖尿病心臟病變的關(guān)系，以期為臨床預(yù)防和治療糖尿病心臟病變提供一定的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年4月至2015年4月于我院心內(nèi)科門診及住院接受治療的T2DM 合并心臟病變患者102 例（T2DM+HD 組），其中男60 例，女42 例，糖尿病病程在10～19年，平均（14.69 ±4.22）年，年齡46～71 歲，平均（57.92±8.46）歲，所有研究對(duì)象均符合1999年世世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）有關(guān)糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及2013年歐洲心臟病學(xué)會(huì)心臟病變（糖尿病性心臟病包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，糖尿病性心肌病、微血管病變和自主神經(jīng)功能紊亂所致的心律及心功能失常）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，采用調(diào)整后雙腔Simpson 法測(cè)得左室射血分?jǐn)?shù)50%以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：T1DM，合并有其他糖尿病并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病足等；臨床診斷為繼發(fā)性高血壓、房顫或其他嚴(yán)重心律失常，中到重度瓣膜疾病、先天性心臟病；超聲檢查顯示靜息或負(fù)荷室壁運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)異常及圖像質(zhì)量顯示不理想；合并有嚴(yán)重的全身其他系統(tǒng)疾病，近期有重大外傷或手術(shù)治療者，出現(xiàn)高熱或者慢性感染者；可能影響心臟功能的非心臟疾病，如甲亢、貧血、慢性酒精中毒等。選取同期在我院門診、內(nèi)分泌科住院，病程≤1年的單純T2DM 患者96 例（T2DM 組），其中男54 例，女42 例，年齡49～70 歲，平均（57.29±6.64）歲，單純T2DM 患者符合美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（American Dia?betes Association，ADA）（2009年）和1999年WHO制定的有關(guān)T2DM 診斷標(biāo)準(zhǔn)，需要排除DPN、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病以及糖尿病血管病變患者；另選取同期在我院經(jīng)體檢合格的健康人員60 例作為對(duì)照組（NC 組），男36 例，女24 例，年齡43～69 歲，平均（56.77 ± 8.42）歲。3 組對(duì)象在年齡、性別方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），數(shù)據(jù)具有可比性。3 組研究對(duì)象均簽訂知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集所有受試對(duì)象年齡、性別、T2DM 病程、心臟疾病病程、體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）、血壓、心率、吸煙史（近1年內(nèi)每周吸煙＞10 支）以及飲酒史。受試對(duì)象禁食8h，清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL 用于檢測(cè)空腹血糖（fast?ing plasma glucose，F(xiàn)PG）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL?C）、高密度脂蛋白膽固醇（high?density lipoprotein cholesterol，HDL?C），均采用美國(guó)雅培C8000 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)、糖化血紅蛋白（HbA1c，ARKRAY HA8160 糖化血紅蛋白分析儀檢測(cè)），超敏C 反應(yīng)蛋白（hypersensitive C?reactive protein，hs?CRP，免疫增強(qiáng)比濁法），游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA，酶比色法）。

1.2.2 左室功能檢測(cè) 受試對(duì)象取仰臥位，保持呼吸通暢，同步記錄心電圖（儀器為HP5500型彩色多普勒超聲診斷儀），探頭頻率為2.0～4.0 MHz。行常規(guī)二維超聲及血流多普勒檢測(cè)，心尖四腔心切面取樣容積主要位于二尖瓣瓣尖處，獲取二尖瓣血流頻譜圖，主要測(cè)量舒張?jiān)缙诜逯盗魉伲╡arly diastolic peak flow velocity，VE）、舒張晚期峰值流速（late dia?stolic peak flow velocity，VA）以及E 峰減速時(shí)間（E peak deceleration time，VEDT），計(jì)算VE/VA。心尖四腔心以及兩腔心采用雙腔Simpson法測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，LVEF）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diam?eter，LVESD）、左心室后壁厚度（left ventricular poste?rior wall thickness，LVPWT）、室間隔厚度（interven?tricularseptal thickness，IVST）、左室心肌重量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）。

1.2.3 PCR?RFLP 技術(shù)檢測(cè)SCN5A 基因C5457T位點(diǎn)多態(tài)性 空腹抽取受試對(duì)象肘靜脈血樣標(biāo)本5 mL 置于含有EDTA 的EP 管中，采用傳統(tǒng)的酚?氯仿法提取樣本中DNA，保存于-80 ℃冰箱中備用，采用PCR?RFLP 技術(shù)檢測(cè)SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)多態(tài)性。引物以及探針經(jīng)Primer Express 2.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并經(jīng)上海生工生物科技有限公司合成。上游引物序列：5′? CGCGTACGATCGCTGGC?TAGC ?3′，下游引物序列：5′? GGCGATCGACTA?AGTACGCTACTAC?3′，。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL，其中含有5 μL PCR 緩沖液，上游及下游引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA 聚合酶0.25 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4.0 μL，剩余加入雙蒸水。SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，而后按照94 ℃30 s、59 ℃30 s、62 ℃15 s 的順序進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，最后以62 ℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為310 bp。所有樣本均在ABI?7500 fast RT?PCR 電泳儀上進(jìn)行反應(yīng)，抽取10%的樣本進(jìn)行基因測(cè)序，從而確定基因分型檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.3 隨訪 所有糖尿病心臟病變患者均接受隨訪，隨訪截止時(shí)間為2018年5月1日，隨訪中位時(shí)間為13 個(gè)月，隨訪最長(zhǎng)時(shí)間3年1 個(gè)月，隨訪方式為門診隨診、電話咨詢等方式，隨訪以患者出現(xiàn)心血管事件（指心源性死亡及因心臟相關(guān)疾病再次入院）或到隨訪截止時(shí)間為終點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，3組基因型間采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD?t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位距）表示，采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用R×C χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。群體基因型采用Hardy?Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用非條件的Logistic回歸分析檢測(cè)SCN5A基因C5457T位點(diǎn)與糖尿病心臟病變的遺傳效應(yīng)之間的關(guān)系，并經(jīng)多重檢驗(yàn)P值的Bonferroni 對(duì)年齡、性別等干擾因素進(jìn)行校正，采用Kaplan?Meier法進(jìn)行生存分析，累積危險(xiǎn)曲線比較采用Log Rank檢驗(yàn)，所獲取數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCN5A 基 因C5457T 位 點(diǎn) 的PCR 產(chǎn) 物SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)酶切中呈現(xiàn)一條亮的且長(zhǎng)度為310 bp 的條帶為TT 型；出現(xiàn)123 bp、177 bp、310 bp 三條亮帶的為CT 型，出現(xiàn)在123 bp、177 bp 兩條帶為CC 型。隨機(jī)選取SCN5A 基因C5457T 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物行基因測(cè)序，結(jié)果顯示堿基的改變與酶切結(jié)果一致（圖1）。

圖1 SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增及電泳圖Fig.1 PCR amplification and electrophoresis map of C5457T site in SCN5A gene

2.2 一般臨床資料結(jié)果比較 研究顯示，T2DM +HD 組、T2DM 組BMI、FPG、HbA1c、TG、HDL?C、hs?CRP、FFA，與NC 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。T2DM+HD組高血壓史、HbA1c、TG、LDL?C、HDL?C、hs?CRP、FFA、VE/VA、IVST、LVMI、LVEF、LVEDD，與T2DM 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組受試者一般臨床資料結(jié)果比較Tab.1 Comparison of general clinical data between groups ±s

表1 各組受試者一般臨床資料結(jié)果比較Tab.1 Comparison of general clinical data between groups ±s

注：與NC 組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與T2DM 組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01

組別NC 組T2DM 組T2DM+HD 組F 值P 值HbA1c（%）5.01±0.48 6.82±0.86*8.96±0.94#△9.866 0.004 TC（mmol/L）4.39±0.67 4.69±0.73 4.77±0.75 0.297 0.786 TG（mmol/L）1.46±0.27 2.98±0.34*4.86±0.72#☆11.997 0.030 LDL?C（mmol/L）2.19±0.59 2.79±0.63 3.37±0.81*△7.224 0.018 HDL?C（mmol/L）1.52±0.29 1.14±0.21*0.83±0.19#△7.521 0.017 hs?CRP（mg/L）2.64±0.51 5.96±0.64#8.99±0.76#☆13.515 0.000 FFA（mmol/L）0.73±0.24 1.36±0.29*1.88±0.42#△11.952 0.000組別NC T2DM T2DM+HD F/χ2值P 值性別（男/女）36/24 54/42 60/42 0.134 0.714年齡（歲）56.77±8.42 57.29±6.64 57.92±8.46 0.366 0.628 BMI（kg/m2）23.74±2.69 25.94±2.51*25.97±3.03*5.032 0.043高血壓病史［例（%）］12（20.00）25（26.04）50（49.02）#☆11.097 0.003吸煙史［例（%）］37（61.67）59（61.46）65（63.73）0.109 0.742 FPG（mmol/L）5.27±0.61 8.26±0.91#8.64±1.03#8.997 0.010組別NC T2DM T2DM+HD F 值P 值VE/VA 0.74±0.08 0.79±0.010 0.51±0.08*△5.435 0.039 IVST（mm）11.12±1.14 12.09±1.21 18.06±1.38*△10.262 0.001 LVMI（g/m2）132.54±29.81 136.94±30.54 178.33±34.63*△9.882 0.004 LVEF（%）64.51±4.47 61.94±5.22 51.68±6.84*△6.881 0.024 LVEDD（mm）50.26±4.27 49.87±4.31 42.58±4.72*△6.822 0.026 LVESD（mm）38.64±5.74 39.84±5.44 40.21±6.10 1.101 0.147 LVPWT（mm）12.49±0.80 11.98±0.91 11.68±0.97 1.921 0.122

2.3 SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)基因型分布 研究顯示，3 組研究對(duì)象SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)基因型及C、T 等位基因頻率符合Hardy?Weinberg 遺傳平衡定律，說(shuō)明符合群體代表性。T2DM + HD 組TT基因型、T等位基因頻率高于NC組、T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.678、23.135、9.677、10.747，P＜0.01）；T2DM組T等位基因頻率與NC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.468，P＜0.05），見表2。

表2 SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)基因型分布情況比較Tab.2 Comparison of genotype distribution of C5457T loci in SCN5A gene 例（%）

2.4 糖尿病心臟病變的回歸分析 以T2DM+HD作為因變量（是為1，否為0），以T2DM + HD 組與NC 組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量行Logistic回歸分析，高血壓史、HbA1c、TG、HDL?C、hs?CRP、FFA、IVST、LVMI 為T2DM + HD 的影響因素（表3）。

表3 糖尿病心臟病變的Logistic 回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of diabetic heart disease

2.5 不同基因型臨床生化指標(biāo)表達(dá)結(jié)果 研究顯示，TT 型患者TG、LDL?C、HbA1c、hs?CRP、FFA、IVST、LVMI，與CC型、CT型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），CT 型患者h(yuǎn)s?CRP、FFA，與CC型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.6 糖尿病心臟病變不同基因型患者隨訪分析 通過(guò)隨訪研究發(fā)現(xiàn)，TT型患者出現(xiàn)心血管事件累積發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與CC型、CT型患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log χ2=5.586、4.763，P=0.015、0.027），見圖2。

3 討論

糖尿病心臟病變是T2DM 較為常見的心血管并發(fā)癥之一，與心肌代謝紊亂、心肌細(xì)胞纖維化、微血管內(nèi)皮功能損傷以及自主神經(jīng)病變等有密切關(guān)系，臨床表現(xiàn)可從無(wú)癥狀發(fā)展至嚴(yán)重的心律不齊、急性心肌梗死、心力衰竭乃至心源性死亡等［7］。目前，有研究認(rèn)為導(dǎo)致糖尿病心臟病變的危險(xiǎn)因素主要包括高齡、女性、遺傳因素、血糖、血脂代謝紊亂、高血壓、高胰島素血癥等［8］。為了進(jìn)一步闡明影響糖尿病心臟病變的危險(xiǎn)因素，我們將納入的102 例糖尿病心臟病變患者行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，高血壓史、HbA1c、TG、HDL?C、hs?CRP 等均為糖尿病心臟病變的危險(xiǎn)因素，提示高血壓、血糖控制水平、血脂異常以及炎癥反應(yīng)均有可能導(dǎo)致糖尿病心臟病變的發(fā)生。

人類SCN5A 基因?yàn)殡妷洪T控Na+通道基因家族中的一員，位于染色體3P21，編碼電壓門控性Na+通道基因，含有4 組同源結(jié)構(gòu)域，含有28 個(gè)外顯子［9］。研究發(fā)現(xiàn)［10?11］，SCN5A 基因變異不僅能夠?qū)е滦穆墒СＰ约膊?，如長(zhǎng)QT 綜合征、特發(fā)性室顫以及心臟傳導(dǎo)阻滯等相關(guān)疾病，而且SCN5A 基因不同位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與心臟Na+通道疾病有關(guān)。目前研究的與心臟病變有關(guān)的SCN5A 的多態(tài)位點(diǎn)有H55R、P1090L、D1819D、C5457T 等，但目前對(duì)于SCN5A 基因多態(tài)性與糖尿病心臟病變的關(guān)系研究報(bào)道相對(duì)較少，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)存在基因分型、等位基因頻率分布差異，糖尿病心臟病變患者TT 型、T 等位基因頻率顯著高于單純T2DM 患者、NC 組人員，提示該基因位點(diǎn)可能為糖尿病心臟病變的易感基因。為了分析探討糖尿病心臟病變患者不同基因分型之間是否存在臨床生化指標(biāo)表達(dá)差異，本研究進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)TT 型 患 者TG、LDL?C、HbA1c、hs?CRP、FFA、IVST、LVMI高于CC型、CT型患者，表明SCN5A 基因C5457T 位點(diǎn)不同基因分型之間存在臨床生化指標(biāo)表達(dá)及左室功能異常差異。值得注意的是，目前對(duì)于糖尿病心臟病變遠(yuǎn)期心血管事件的研究分析較少。本研究發(fā)現(xiàn)，TT 型患者遠(yuǎn)期發(fā)生心血管事件的累積危險(xiǎn)發(fā)生率明顯高于CC型，筆者認(rèn)為可能與TT 型患者血脂、心室功能異常程度更高存在因果關(guān)系。同時(shí)，早期的研究［10］已證實(shí)SCN 5A 基因的變異與多種嚴(yán)重心律失常關(guān)系密切，而CC 基因型為保護(hù)型，但CC 型是否單純通過(guò)改善血脂、心功能和心律失常發(fā)揮心血管保護(hù)作用，有待進(jìn)一步探索。

表4 不同基因型臨床生化指標(biāo)表達(dá)結(jié)果Tab.4 Expression of clinical and biochemical indexes of different genotypes ±s

表4 不同基因型臨床生化指標(biāo)表達(dá)結(jié)果Tab.4 Expression of clinical and biochemical indexes of different genotypes ±s

注：與CC 基因型比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與CT 基因型比較，△P＜0.05

基因型Genotypes CC CT TT F 值P 值VE/VA 0.53±0.09 0.53±0.010 0.50±0.08 0.435 0.639 IVST（mm）15.68±0.94 16.36±0.61 19.27±0.57*△8.262 0.018 LVMI（g/m2）159.94±21.97 167.52±20.69 192.33±22.49*△9.882 0.004 LVEF（%）54.47±3.28 52.63±3.22 49.79±3.17 1.881 0.133 LVEDD（mm）43.41±3.74 42.19±3.39 41.63±3.42 2.042 0.102 LVESD（mm）39.86±6.14 39.42±6.63 41.83±5.97 1.101 0.147 LVPWT（mm）11.99±0.92 11.03±0.96 10.97±0.92 1.921 0.122基因型CC CT TT F 值P 值TG（mmol/L）3.69±0.96 3.82±0.98 5.13±0.89#△11.443 0.000 TC（mmol/L）4.66±0.86 4.74±0.92 4.91±0.90 1.098 0.104 LDL?C（mmol/L）2.88±0.65 3.03±0.41 3.52±0.43*△8.993 0.017 HDL?C（mmol/L）0.87±0.19 0.82±0.14 0.80±0.13 0.232 0.781 HbA1c（%）8.13±0.67 8.62±0.74 9.61±0.61*△8.138 0.019 FPG（mmol/L）8.53±0.61 8.62±0.64 9.16±0.67 1.288 0.142 hs?CRP（mg/L）6.34±0.51 8.44±0.61*9.32±0.53#△23.524 0.000 FFA（mmol/L）1.14±0.51 1.51±0.49*1.96±0.50#△17.824 0.000

圖2 Kalplan?Meier 法分析不同基因型患者心血管事件累積危險(xiǎn)曲線Fig.2 Cumulative risk curves Kalplan?Meier analysis of cardiovascular events in patients with different genotypes

需要指出的是，目前研究證實(shí)無(wú)明顯心臟病變的無(wú)癥狀糖尿病患者可能已經(jīng)存在左心室功能異常［12］，因此及時(shí)對(duì)糖尿病患者進(jìn)行生活方式調(diào)整和藥物干預(yù)有助于減少糖尿病心衰的發(fā)生。臨床有研究顯示［13］，早期心臟功能受累的糖尿病患者均存在早期舒張、收縮功能異常。目前普遍認(rèn)為糖尿病心臟變與代謝異常、心肌纖維化、心肌細(xì)胞肥大等有一定關(guān)系［14］。本研究顯示，糖尿病心臟病變組VE/VA、IVST、LVMI、LVEF、LVEDD，與T2DM 組、NC 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Lo?gistic 回歸分析顯示，IVST、LVMI 為糖尿病心臟病變的影響因素。長(zhǎng)期的全身小動(dòng)脈血管腔狹窄是導(dǎo)致周圍血管阻力升高進(jìn)而引起左心室肥厚的重要原因，而左心室肥厚能引發(fā)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，研究顯示血脂異常與IVST、LVMI 等指標(biāo)相關(guān)［15］，血脂代謝異常也是導(dǎo)致左心室肥厚的重要影響因素之一。因此，筆者認(rèn)為糖尿病患者血脂代謝異常引起全身小動(dòng)脈血管狹窄、導(dǎo)致糖尿病患者左心室肥厚，進(jìn)而引起糖尿病心臟病變。但需要指出的是，血脂代謝是如何導(dǎo)致糖尿病患者左心室功能變化有待進(jìn)一步研究。通過(guò)基因多態(tài)性分析也顯示，TT 基因型TG、LDL?C、FFA 等血脂指標(biāo)以及IVST、LVMI 等左心室功能指標(biāo)與CT、CC型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這在一定程度上說(shuō)明不同基因型血脂代謝不盡相同，這對(duì)于課題組后續(xù)進(jìn)一步研究糖尿病心臟病變以及藥物干預(yù)有一定的研究意義。

綜上，SCN5A 基因多態(tài)性為糖尿病心臟病變患者左室功能障礙易感基因，其可能與血脂代謝異常相關(guān)。