慢性阻塞性肺病患者呼出氣冷凝液白細(xì)胞介素33 與氣道嗜酸性粒細(xì)胞的關(guān)系

古輝 徐小彭 黃國華 李雪平 陳少立

佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科（廣東佛山528500）

慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease ，COPD）是老年人中最常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病之一，也是導(dǎo)致全球老年人死亡的主要疾病之一［1］。越來越多的證據(jù)表明，嗜酸性粒細(xì)胞性COPD 是該疾病的一種獨特表型，其特征是惡化風(fēng)險較高但吸入糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)較好［2］。與老年人相比，COPD 受試者痰中嗜酸性粒細(xì)胞百分比和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白濃度顯著增高，并且在疾病惡化期間，其氣道嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加［3］。既往研究［4］數(shù)據(jù)顯示，37.4%的COPD 患者表現(xiàn)出持續(xù)的血液嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)大于或等于2%。血液嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)增高的非過敏性COPD 患者其特征是氣道嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，痰中白細(xì)胞介素（IL）?5 和觸珠蛋白水平升高，伴隨著顯著的氣道重塑，其支氣管肺泡灌洗液（BAL）中的趨化因子CCL20 和CCL24 濃度也顯著增高，表明這種嗜酸性粒細(xì)胞在COPD 的炎癥和氣道重塑過程中發(fā)揮重要的作用［5］。

白細(xì)胞介素33（interleukin 33，IL?33）主要由上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是應(yīng)答細(xì)胞外各種病變而產(chǎn)生的警報性因子之一［6］。最近的研究［7］表明，IL?33 在IL?5 之前調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的作用，是嗜酸性粒細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)所必需的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL?33 可以激活并增強(qiáng)造血祖細(xì)胞（hemopoietic progenitor cells，HPC）的成熟。HPC 被認(rèn)為是過敏性哮喘中的先天效應(yīng)細(xì)胞［8］：它們產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子，并在炎癥部位的“原位造血”過程中分化為成熟的嗜酸性粒細(xì)胞，但目前對于IL?33 其與COPD患者中氣道嗜酸性粒細(xì)胞的關(guān)系仍未明確。呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）中存在大量的介質(zhì)因子，其能反應(yīng)呼吸道中各種病理變化，并有望成為呼吸疾病新的生物標(biāo)記物重要來源標(biāo)本。本研究旨在探討COPD 患者中呼出氣冷凝液中IL?33 的表達(dá)水平，并探討其與COPD 患者中嗜酸性粒細(xì)胞以及炎癥程度之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年9月至2018年7月于我院就診的COPD 患者共60 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》［9］的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡不限；（3）獲得患者知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并機(jī)體免疫性疾病的患者；（2）合并惡性腫瘤；（3）合并支氣管哮喘、擴(kuò)張、肺結(jié)核的患者；（4）合并急性心肌梗死的患者；（5）近1 個月內(nèi)采用免疫抑制劑或激素治療的患者；（6）合并全身炎癥反應(yīng)及內(nèi)分泌疾病的患者。選擇同期年齡相近的健康體檢者共50 例作為對照組，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

1.2 檢測指標(biāo)和方法 （1）呼出氣冷凝液的收集和保存：所有參與者采用便攜式呼出氣冷凝液收集器收集呼出氣冷凝液，在收集之前充分讓患者了解操作流程。囑托患者收集前先采用蒸餾水漱口，充分清理口腔中的食物殘渣和分泌物；收集時讓患者做平靜呼吸，收集時間為20 min，在收集期間注意冷凝管溫度的穩(wěn)定性。將收集到的冷凝液存儲于2 mL 的冷凍管，并在收集完30 min 后放-80 ℃冰箱進(jìn)行保存以待檢測。（2）血液樣本的收集：所有參與者清晨空腹抽取靜脈全血，置于真空抗凝管保存，經(jīng)3 000 r/min 離心后，取血清保存于-80 ℃冰箱進(jìn)行保存以待檢測。（3）ELISA 檢測：檢測冷凝液中的IL?33 的表達(dá)水平，同時檢測血清的IL?33、IL?6、IL?8、TNF?α的水平，所有試劑盒購自R&D SYSTEM，嚴(yán)格按照說明書的步驟規(guī)范操作。（4）氣道嗜酸性粒細(xì)胞檢測：所有COPD 患者健康受試者通過氣道霧化收集痰液，經(jīng)過消化并過濾后，將過濾液在離心后固定采用HE 染色，對標(biāo)本在鏡下進(jìn)行觀察計數(shù)，記錄嗜酸性粒細(xì)胞的比例。

1.3 臨床指標(biāo)記錄 記錄所有COPD 患者和參與者的基本資料，包括年齡、性別、BMI、是否為穩(wěn)定期或AECOPD；記錄所有COPD 患者的肺功能檢測指標(biāo)，根據(jù)肺功能檢測采用GOLD 分級系統(tǒng)對肺功能進(jìn)行分級，記錄所有患者的血常規(guī)中的嗜酸性粒細(xì)胞水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK 法檢驗；計數(shù)資料采用百分比表示，比較采用卡方檢驗，兩指標(biāo)的相關(guān)性評估采用Spearman 相關(guān)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 兩組患者的平均年齡、性別比例和平均BMI 比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），60 例COPD 患者其平均病程為（4.2 ± 1.8）年，其中處于COPD穩(wěn)定期的39例，急性加重期的21 例，GOLD 分級Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別為21、28、11 例（表1）。

表1 兩組患者的一般情況比較Tab.1 Comparison of general conditions between the two groups of patients±s，例

表1 兩組患者的一般情況比較Tab.1 Comparison of general conditions between the two groups of patients±s，例

臨床項目年齡（歲）性別（男/女）BMI(kg/m2)病程（年）分期（穩(wěn)定期/AECOPD）GOLD 分級(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ)COPD 組（n=60）67.2±5.7 34/26 23.1±1.9 4.2±1.8 39/21 21/28/11對照組（n=50）65.6±7.3 31/19 22.8±2.3- - -t/χ2值t=1.290 χ2=0.321 t=0.749- - -P 值0.200 0.571 0.455- - -

2.2 兩組患者其IL?33 及相關(guān)臨床指標(biāo)對比 其中COPD 組的平均呼出氣冷凝液IL?33 水平為（3.1±0.6）pg/mL，顯著高于對照組的（1.4±0.5）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.943，P＜0.05）；且COPD 組的平均氣道嗜酸性粒細(xì)胞比例、血嗜酸性粒細(xì)胞比例、血清IL?33、IL?6、IL?8 和TNF?α水平均顯著高對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中COPD 組的平均FEV1/FVC 為（56.7 ± 6.8）%（表2）。

表2 兩組患者的相關(guān)臨床指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of relevant clinical indicators between the two groups of patients±s

表2 兩組患者的相關(guān)臨床指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of relevant clinical indicators between the two groups of patients±s

臨床參數(shù)冷凝液IL-33（pg/mL）氣道嗜酸性粒細(xì)胞（%）血嗜酸性粒細(xì)胞（%）血清IL-33（pg/mL）IL-6（pg/mL）IL-8（pg/mL）TNF-α（pg/mL）FEV1/FVC（%）COPD 組（n=60）3.1±0.6 3.4±0.7 4.3±1.9 35.2±7.4 193.1±41.5 52.5±21.1 74.7±24.5 56.7±6.8對照組（n=50）1.4±0.5 0.9±0.2 2.5±1.3 22.6±5.5 108.1±32.3 10.6±4.5 16.9±8.6-t 值15.943 24.420 5.680 9.961 11.804 13.773 15.877-P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001-

2.3 不同嚴(yán)重程度COPD 患者的呼出氣冷凝液IL?33 水平對比 其中AECOPD 的COPD 患者呼出氣冷凝液IL?33 水平顯著高于穩(wěn)定期的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.268，P＜0.001），且不同GOLD 分級COPD 患者的呼出氣冷凝液IL?33 水平對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.127，P=0.004），其中GOLD 分級Ⅳ級的呼出氣冷凝液IL?33 水平顯著高于Ⅱ級和Ⅲ級，GOLD 分級Ⅲ級的顯著高于Ⅱ級，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同分期和GOLD 分級COPD 患者的呼出冷凝液IL?33 水平比較Tab.3 Comparison of exhaled lysate IL?33 levels in COPD patients with different stages and GOLD grade ±s

表3 不同分期和GOLD 分級COPD 患者的呼出冷凝液IL?33 水平比較Tab.3 Comparison of exhaled lysate IL?33 levels in COPD patients with different stages and GOLD grade ±s

指標(biāo)分期穩(wěn)定期AECOPD GOLD 分級Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級例數(shù)39 21 21 28 11冷凝液IL?33（pg/mL）2.7±0.3 4.7±0.6 2.9±0.3 3.4±0.5 4.3±0.5 t/F 值17.268 5.127 P 值＜0.001 0.004

2.4 呼出氣冷凝液IL?33 水平與嗜酸性粒細(xì)胞及炎癥因子的相關(guān)性 60 例COPD 患者呼出氣冷凝液IL?33 水平與血清IL?33、氣道嗜酸性粒細(xì)胞比例、血嗜酸性粒細(xì)胞比例、IL?6、IL?8 和TNF?α呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05），呼出氣冷凝液IL?33 水平與肺功能指標(biāo)中的FEV1/FVC 呈顯著的負(fù)相關(guān)（r＝?0.392，P＝0.002）（表4）。

表4 呼出氣冷凝液IL?33 水平與各項指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of IL?33 level of exhaled condensate and various indicators（n=60）

3 討論

呼出氣冷凝液（EBC）有望成為肺部疾病新的生物標(biāo)志物的重要來源。EBC 可以被認(rèn)為是體液或呼出氣體的冷凝物，能反映氣道中呼吸道液體成分的變化［10］。研究表明，EBC 中可能包含過氧化氫、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子，類二十烷酸，和大分子如粘蛋白，磷脂和DNA 等一系列成分和因子。在疾病狀態(tài)中，EBC 含有反映該疾病的分子或更高濃度的特定標(biāo)記物。例如，患有胃食管反流病的患者在其EBC 中已被證實患有胃蛋白酶。已經(jīng)有研究證實COPD 和哮喘患者在支氣管激發(fā)后在EBC中的活性氧水平和組胺水平顯著升高。

IL?33 是IL?1 家族的新成員，由于其在免疫應(yīng)答中的功能而引起了極大的關(guān)注。它主要在各種炎癥中的細(xì)胞和組織表達(dá)。免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞均可以在特定的刺激下產(chǎn)生IL?33［11］。已知IL?33 是ST2 的配體，并且在免疫應(yīng)答和炎性疾病中起重要作用。除了Th2 型免疫反應(yīng)外，最近的研究表明，IL?33 通過促進(jìn)自然殺傷和自然殺傷T 細(xì)胞分泌Th1 型細(xì)胞因子，對Th1 型反應(yīng)有顯著影響。 IL?1 受體相關(guān)蛋白ST2 和IL?1 受體輔助蛋白（IL?1RAcP）是IL?33 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的受體，研究表明，在病變的肺組織中可檢測到高表達(dá)水平的IL?33，表明IL?33 其在呼吸系統(tǒng)疾病中起重要作用。既往研究［12］已經(jīng)顯示雖然已報道COPD 患者的血清ST2 和IL?33 水平升高，但EBC中的IL?33 在COPD 的表達(dá)水平和與臨床疾病關(guān)系仍未明確。高達(dá)40%的慢阻肺患者中發(fā)現(xiàn)類似哮喘患者的嗜酸粒細(xì)胞的氣道炎癥，雖然研究［13］表明嗜酸性粒細(xì)胞可能通過參與自身免疫失衡而參與慢阻肺的病理生理進(jìn)程，但對于COPD 中嗜酸性粒細(xì)胞的功能仍未明確。本研究中，明確了在COPD 患者中EBC 中的IL?33 水平顯著增高，且與氣道誘導(dǎo)痰的嗜酸性粒細(xì)胞比例以及血清多項炎癥因子水平呈顯著的正相關(guān)，表明了IL?33 參與了COPD 的炎癥反應(yīng)，并潛在參與COPD 患者嗜酸性粒細(xì)胞的激活。

既往有研究通過檢測到肺組織的IL?33 表達(dá)水平顯著增高，表明IL?33 上調(diào)可能參與系統(tǒng)性炎癥和COPD 氣道炎癥［14］。本研究采用ELISA 法檢測了COPD 和健康參與者的EBC 中的IL?33 表達(dá)水平，結(jié)果顯示了COPD 患者其EBC 中的IL?33 水平顯著升高，且IL?33 表達(dá)水平與COPD 患者的分期和分級情況密切相關(guān)，這也從另一種檢測手段確認(rèn)了IL?33 參與COPD 患者的機(jī)體發(fā)病機(jī)制。本研究中也檢測了所有參與者中的血清IL?33 表達(dá)水平，且血清IL?33 與EBC 中的IL?33 表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.778，表明了EBC 的IL?33 表達(dá)水平能反映患者血清的IL?33 表達(dá)水平。同時，對血清檢測的進(jìn)一步結(jié)果顯示其IL?6、IL?8 和TNF?α水平均顯著升高，同時氣道中嗜酸性粒細(xì)胞比例也顯著升高，這與既往研究結(jié)果相一致。既往研究顯示，在呼吸道刺激物刺激下，IL?33 和ST2 在小鼠肺組織中顯著高表達(dá)，其伴有中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞滲透增多，顯示了IL?33 是氣道炎癥中的細(xì)胞因子和趨化因子。且研究［15］結(jié)果證明了EBC 中的IL?33 蛋白是可檢測的，EBC 中的IL?33 水平與氣道嗜酸性粒細(xì)胞比例、IL?6、IL?8 和TNF?α呈顯著的正相關(guān)證明了氣道EBC 能良好地反應(yīng)COPD 患者的全身炎癥指標(biāo)狀態(tài)。有研究顯示IL?33 可以通過ST2 受體促進(jìn)COPD 患者的IL?6 和IL?8 的產(chǎn)生參與早期的抗炎調(diào)節(jié)機(jī)制。COPD 患者氣道中嗜酸粒細(xì)胞增多，且嗜酸性粒細(xì)胞中也存在ST2 的表達(dá)，因此，IL?33 可通過ST2 激活嗜酸性粒細(xì)胞導(dǎo)致產(chǎn)生超氧化物和IL?8等炎癥因子，維持嗜酸性粒細(xì)胞存活。這可能是IL?33與氣道嗜酸性粒細(xì)胞呈顯著正相關(guān)的主要原因。因此，針對嗜酸性粒細(xì)胞在COPD 的重要作用，通過抑制IL?33 介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞激活有可能成為控制COPD 患者炎癥進(jìn)展的重要途徑，但對于氣道中IL?33 具體介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞激活的機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

綜合上述，本研究結(jié)果表明了COPD 患者呼出氣冷凝液IL?33 的表達(dá)水平顯著增高，氣道IL?33參與了COPD 患者的病情進(jìn)展，且與氣道和外周血中的嗜酸性粒細(xì)胞比例及血清IL?6、IL?8 和TNF?α水平顯著相關(guān)。