葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

武雪亮 王立坤 屈明 周海豐 郭飛 楊永江 劉博 楊東東 薛軍

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1普通外科，2超聲醫(yī)學(xué)科，3病理科（河北張家口075000）

據(jù)報(bào)道20～40 歲的青年結(jié)直腸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者，其5年生存率分別為87.9%、75.4%、51.3%、8.0%，60歲以上老年患者的5年生存率則分別為91.9%、69.8%、52.8%、6.6%，因此早期診斷、合理治療和有效的預(yù)后監(jiān)測(cè)是提高結(jié)直腸癌療效的關(guān)鍵［1-2］。但目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA199等的早期檢測(cè)并不令人滿意，因而，尋求一種特異性高、敏感性強(qiáng)的生物學(xué)指標(biāo)勢(shì)在必行。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（glucose transporter?1，GLUT?1）是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的重要成員，廣泛分布于機(jī)體的細(xì)胞膜上，是介導(dǎo)葡萄糖攝取的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其表達(dá)水平與機(jī)體細(xì)胞葡萄糖代謝水平密切相關(guān)。相關(guān)報(bào)道證實(shí)［3-5］，GLUT?1 在前列腺癌、胃癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌等多種癌癥中均有過表達(dá)。但目前，GLUT?1 在結(jié)直腸癌方面的研究較少，相關(guān)的致癌機(jī)制和通路尚不明確。本研究通過檢測(cè)GLUT?1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析其與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，結(jié)合生存時(shí)間的隨訪，為結(jié)直腸癌的早期診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供準(zhǔn)確、可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象為2012年2月至2014年2月間河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理確診結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本各50 例，同時(shí)收集患者完整的臨床資料。

1.2 主要試劑與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人Glut?1（NBP1?35926）購于上海煊翎生物科技有限公司，羊抗鼠IgG?HRP二抗（SE134），購于北京索萊寶科技有限公司，DAB（P0202），上海碧云天生物公司，PBS 液（PH 7.2～7.4）購于廣州鼎國生物科技有限公司，構(gòu)椽酸鹽緩沖液（PH 6.0）購于廣州鼎國生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于長沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司，SDS?PAGE 標(biāo)準(zhǔn)指示劑、RIPA 試劑購于上?；巧锟萍加邢薰?、BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Life Technologies 公司。

1.2.2 RT?PCR 法檢測(cè)GLUT?1 mRNA 表達(dá) 提取并測(cè)定總RNA，設(shè)計(jì)GLUT?1 上游引物：5′?TCT?CTGGGTAAACAGGGATCAAACA?3′，下游引物：5′?TGAGGAGCAGGAAGGGTC?3′；GAPDH 上游引物：5′?GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG?3′，下游引物：5′?CCTGGAAGATGGTGATGGGATT?3′；反應(yīng)體系：1×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，cDNA 模板2 μL，Taq 酶1.25 U，上下游引物各1 μL，RNA 酶抑制劑1 μL，反應(yīng)總體積25 μL。根據(jù)試劑盒說明書操作進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂電泳后以Labworks 4.5 圖像分析系統(tǒng)分析。

1.2.3 Western blot 法檢測(cè)GLUT?1 蛋白表達(dá) 提取正常腸粘膜、腺癌組織50 mg 蛋白，置入5×緩沖液（4∶1），100 ℃水浴，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，取出膜，加5%脫脂奶粉封閉，滴加特異性的一抗（GLUT?1 為1∶1 500，GAPDH 為1∶150）-4 ℃孵育過夜，滴加特異性二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1h，再次加入TBST 洗滌液，熒光成像檢測(cè)定量分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)GLUT?1 蛋白表達(dá) 制作結(jié)直腸腺癌和正常黏膜的石蠟包埋組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋并切片3～4 μm厚。石蠟切片放入3%H2O2，二甲苯（Ⅱ脫蠟各10 min，梯度酒精100%2 min，95%2 min，80%，2 min，70%2 min，蒸餾水洗2 次每次5 min（置于搖床）。3%H2O2中浸泡10 min，蒸餾水洗滌。高壓抗原修復(fù)90 s，室溫冷卻，PBS 洗滌切片。滴加5%BSA 封閉液，37 ℃孵育30 min，滴加GLUT1 一抗（1∶200），4 ℃過夜，37 ℃孵育生物素化的二抗30 min。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核半分鐘，DAB 顯色，鹽酸乙醇脫水至透明、樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.5 結(jié)果判定［6］GLUT?1 陽性染色主要集中于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中，呈棕黃色或褐色顆粒，光鏡下每個(gè)樣本隨機(jī)取五個(gè)高倍視野（× 400）的陽性細(xì)胞數(shù)，取其均值作為GLUT?1 細(xì)胞數(shù)，其中≥1%的細(xì)胞著色定為陽性。

1.2.6 隨訪 通過門診復(fù)查、電話隨訪，時(shí)間為2018年10月30日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，兩組比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，多組比較應(yīng)用方差分析，GLUT?1 陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組之間的生存差異應(yīng)用Log?rank 檢驗(yàn)計(jì)算，用GraphPad Prism 6 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，設(shè)α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 RT?PCR 檢測(cè)GLUT?1 的表達(dá) 以GLUT?1/GAPDH 比值作為RT?PCR 定量分析，癌組織中GLUT?1 mRNA 的表達(dá)水平（0.96 ± 0.05）明顯高于結(jié)直腸正常組織（0.17±0.02），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0.003，見圖1。

2.2 Western blot 檢測(cè)結(jié)直腸正常黏膜、腺癌組織中GLUT?1 蛋白的表達(dá)情況 以GLUT?1/GAPDH比值作為GLUT1 相對(duì)表達(dá)量，顯示與正常腸粘膜組織（0.17 ± 0.05）相比，腺癌（0.84 ± 0.06）組織中的表達(dá)明顯升高，上升趨勢(shì)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，見圖2。

圖1 RT?RCR 檢測(cè)GLUT?1 在結(jié)直腸正常黏膜、結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)水平Fig.1 Expressions of GLUT?1mRNA in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by RT?PCR

2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)直腸正常黏膜、腺癌組織中GLUT1蛋白的表達(dá)情況 結(jié)直腸癌組織中GLUT?1的陽性表達(dá)率為68.00%（34/50）明顯高于在正常組織中的表達(dá)16.00%（8/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，見圖3。

圖2 Western blot 檢測(cè)GLUT?1 蛋白在結(jié)直腸正常黏膜、結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)水平Fig.2 Expressions of GLUT?1 protein in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by Western blot

2.4 GLUT?1 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 GLUT?1 的表達(dá)均與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤相關(guān)（均P＜0.05）。TNM 分期高、分化越低、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤的患者GLUT?1 的表達(dá)均增強(qiáng)；GLUT?1 在CEA（+）、CA199（+）組織中的表達(dá)明顯高于CEA（-）、CA199（-）組，P＜0.05，而GLUT1 的陽性表達(dá)與患者腫瘤大小無相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

2.5 生存分析 將患者分為GLUT?1 陽性組和陰性組，通過對(duì)患者進(jìn)行短期隨訪，記錄患者的生存時(shí)間，同時(shí)分別繪制生存曲線，GLUT?1 陽性組的中位生存時(shí)間為267 d（95%CI：230.07～303.93），最長生存時(shí)間為359 d；陰性組的中位生存時(shí)間為307 d（95%CI：279.16～335.82），最長生存時(shí)間為365 d，兩組間的生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.031，見圖4。

表1 結(jié)直腸癌組織中GLUT?1 的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relation of GLUT?1 expression and the clinicopathological parameters in the colorectal tissues

圖3 免疫組化檢測(cè)GLUT?1 在結(jié)直腸正常黏膜、結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)（×400）Fig.3 Expressions of GLUT?1 protein in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by IHC

圖4 生存曲線Fig.4 Suvival cure

3 討論

研究［7］認(rèn)為，腫瘤的惡性生物學(xué)行徑必須依賴足夠的能量支撐，而葡萄糖的無氧糖酵解是其獲能的最主要途徑，這種獲能方式即使在高氧環(huán)境下亦能保證正常進(jìn)行，因而這就要求必須要有足夠的葡萄糖供應(yīng)。

GLUT?1 是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中的重要成員，在真核生物和原核生物中均有發(fā)現(xiàn)，是所有膜傳輸研究最深入的蛋白質(zhì)。GLUT?1 最初發(fā)現(xiàn)存在于紅細(xì)胞、血腦屏障、眼、胎盤、周圍神經(jīng)和哺乳乳腺的內(nèi)皮細(xì)胞中，通常在正常上皮細(xì)胞和良性上皮腫瘤中無法檢測(cè)到，但在人類多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)GLUT?1 表達(dá)增加［8-10］。GLUT?1 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，包括早期腫瘤生長，轉(zhuǎn)移和侵襲等方面均發(fā)揮重要作用。GLUT?1 介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的基礎(chǔ)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，為腫瘤細(xì)胞能量代謝提供葡萄糖，其誘導(dǎo)血管生成是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的標(biāo)志，當(dāng)癌細(xì)胞生長超過現(xiàn)有的血管支撐時(shí)，就會(huì)發(fā)生缺氧，因此，癌細(xì)胞通過激活負(fù)責(zé)葡萄糖運(yùn)輸?shù)幕颍碐LUT?1 來對(duì)缺氧條件作出反應(yīng)［11］。GLUT?1在惡性腫瘤中的調(diào)控機(jī)制涉及不同的信號(hào)分子和通路，包括PI3K/Akt 信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF?1）、Ras、c?Myc和抑癌蛋白p53。研究證實(shí)［12］，在胃癌、肝癌細(xì)胞內(nèi)，HIF?1α能直接激活GLUT?l、胚胎丙酮酸激酶（PKM?2）、己糖激酶-1（HK?1）和2（HK?2）、乳酸脫氫酶A（LDH?A）等糖酵解相關(guān)因子的活性，加速糖酵解，促進(jìn)能量攝取。周曉黎等［13］研究證實(shí)，GLUT?1 基因沉默通過阻斷PI3K/AKT 信號(hào)途徑，降低HIF?1α表達(dá)，誘導(dǎo)相關(guān)代謝酶下調(diào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的代謝和生長。此外，文獻(xiàn)中還報(bào)道GLUT?1 受胰島素樣生長因子-1、血小板源性生長因子、白介素-1 和TNF 等因子影響，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝［14］。

本研究從基因和蛋白兩方面均證實(shí)了在結(jié)直腸癌細(xì)胞中GLUT?1 mRNA 和蛋白水平明顯高于正常腸黏膜細(xì)胞，表明在腸粘膜癌變的過程中急需大量能量，而GLUT?1 水平的上調(diào)保證了腫瘤對(duì)能量的攝取。進(jìn)一步研究顯示，GLUT?1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的分化程度、病理分期、浸潤深度、轉(zhuǎn)移均明顯相關(guān)，且與CEA、CA199 等腫瘤標(biāo)記物亦相關(guān)，因而表明GLUT?1 表達(dá)的異常激活了腫瘤細(xì)胞的活性并促進(jìn)其侵襲增殖，從而加速癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。GABALLAH 等［15］通過定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)47 名結(jié)腸癌患者和20 名健康對(duì)照者的外周血標(biāo)本中的GLUT1 表達(dá)，結(jié)果表明GLUT1在癌患者的表達(dá)遠(yuǎn)高于健康者，且GLUT1 的表達(dá)與腫瘤分期（P=0.01）和轉(zhuǎn)移情況（P=0.009）顯著相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。此外，WANG 等［16］研究表明在結(jié)直腸癌變及化療耐藥過程中，同樣證實(shí)GLUT?1 作為無氧糖酵解關(guān)鍵性因子發(fā)揮重要作用。本研究通過生存期的隨訪證實(shí)，GLUT?1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存期相關(guān)，陽性表達(dá)者生存時(shí)間明顯低于陰性表達(dá)者，因而GLUT?1 的表達(dá)水平可作為結(jié)直腸癌患者的重要的預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。楊通印等［17］研究證實(shí)聯(lián)合檢測(cè)GLUT?1、HIF?1α及LDH?5 在結(jié)直腸癌的表達(dá)，可作為評(píng)估結(jié)直腸癌的發(fā)展及預(yù)后的分子指標(biāo)。YANG等［18］通過Meta分析亦證實(shí)GLUT?1 是結(jié)直腸癌患者侵襲性（P=0.03）和無疾病生存期（P=0.013）的重要生物學(xué)標(biāo)志物，以上均與本研究成果一致。

綜上，GLUT?1 表達(dá)的異常升高參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展過程，且與預(yù)后相關(guān)，本研究所納入的樣本量尚小，今后要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量；此外，尚缺乏對(duì)其具體致癌機(jī)制和相應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面的研究，這也將是本課題下一步的研究方向。