BTLA、LAG3 和TIM3 在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)意義

朱元媛 閆洪超 劉永利 李欣

1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院（江蘇徐州221002）；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（江蘇徐州221006）；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（江蘇徐州221002）；4徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市婦幼保健院婦科（江蘇徐州221009）

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中病理類型最多且最復(fù)雜的惡性腫瘤之一，疾病發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡年輕化，早期即可出現(xiàn)盆腔腹膜轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，病死率最高［1］，上皮性卵巢癌的診斷及治療已成為研究熱門。新近研究發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞包含抗病毒及抗腫瘤功能，多種免疫抑制受體參與T 細(xì)胞免疫調(diào)控［2］，如淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte activation gene?3，LAG3）、PD?1、CTLA?4、B 和T 淋巴細(xì)胞弱化因子（B and T lymphocyte?attenuator，BTLA）和T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM3）［3］，抑制免疫檢測(cè)點(diǎn)功能，可提高T 細(xì)胞抗腫瘤作用，因而免疫抑制劑占有愈來(lái)愈重要的地位。QUAN等［4］、SEKAR 等［5］、LAN 等［6］在血液腫瘤、乳腺癌小鼠模型及胃癌中證實(shí)BTLA 高表達(dá)。PARRA等［7］研究LAG3 在肺癌中高情況。TIM3 證實(shí)高表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞［8］、肝癌細(xì)胞［9］。迄今為止，在人類實(shí)體腫瘤來(lái)源的細(xì)胞中分析了BTLA、LAG3、TIM3 等共抑制分子［10］，在上皮性卵巢癌的表達(dá)情況的研究罕見(jiàn)。本文首次探討和研究卵巢癌中BTLA、LAG3、TIM3 的表達(dá)情況，證實(shí)其高表達(dá)及作為免疫檢測(cè)點(diǎn)的意義，為免疫抑制劑的制作提供參考。本文應(yīng)用免疫組化PV法檢測(cè)了擁有有效隨訪資料的卵巢上皮性癌患者的卵巢組織，研究LAG3、BTLA 和TIM3 在卵巢癌組織中的表達(dá)，以探討其在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市婦幼保健院及徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市第一人民醫(yī)院在2010年1月至2013年1月期間通過(guò)手術(shù)治療的有隨訪資料的上皮性卵巢癌患者在病理科的組織蠟塊，共84 例，4 例失訪，80 例包括卵巢漿液性腺癌56 例，黏液性腺癌20 例，子宮內(nèi)膜樣腺癌4 例。同時(shí)收集38 例良性上皮性卵巢腫瘤組織蠟塊，包括27 例漿液性囊腺瘤，11 例黏液性囊腺瘤。12 例交界性上皮性卵巢腫瘤組織蠟塊。并隨機(jī)選取同期因子宮肌瘤切除的正常卵巢組織30 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者擁有完整的臨床信息及病理資料；術(shù)后及時(shí)隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；除外轉(zhuǎn)移自生殖系統(tǒng)其他器官的惡性腫瘤；除外首次治療方案為化療、放療或內(nèi)分泌治療?；颊呤中g(shù)日期為隨訪起點(diǎn)，死亡日為隨訪終點(diǎn)，2018年1月為隨訪截止日期。標(biāo)本均取自病理科且經(jīng)病理確診，10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm 切片。上皮性卵巢癌患者以FIGO 分期，WHO 組織學(xué)分級(jí)。隨訪總時(shí)間為3.1～63.2 個(gè)月，中位生存時(shí)間為30.4個(gè)月。本研究均經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且獲得患者及家屬知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 BTLA 兔抗人多克隆抗體、TIM3鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；LAG3 鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam 公司；超敏兔及鼠兩分法試劑盒（PV?9001）、DAB 試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化PV 法，將所有標(biāo)本石蠟切片至于二甲苯及梯度乙醇脫臘水化，PBS浸泡，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，冷卻至室溫，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。特異性一抗（濃度為1∶50 的BTLA 兔抗人；濃度為1∶50 的LAG3 兔抗人；濃度為1∶50 的TIM3 鼠抗人；）滴于標(biāo)本玻片4 ℃過(guò)夜，恢復(fù)室溫后再滴加特異性生物素化二抗，辣根溶液覆蓋玻片樣本，滴加DAB 顯色劑，蘇木素染色，梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹(shù)膠封片，于400 倍顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定 以染色強(qiáng)度結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量分析。BTLA、LAG3和TIM3 均表達(dá)于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒。染色強(qiáng)度分四度：不著色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3 分。鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比分四度：＜1%計(jì)0 分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比1%～30%計(jì)1 分，30%～70%計(jì)2 分，70%～100%計(jì)3 分。每張切片分析時(shí)將兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加，1～2 分為弱陽(yáng)性（+），3～4 分為中陽(yáng)性（++），5～6 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），0 分為陰性（-）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析時(shí)，應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，免疫組化陽(yáng)性表達(dá)情況行卡方檢驗(yàn)，BTLA、LAG3、TIM3 分別與臨床病理因素同樣采用卡方檢驗(yàn)分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kaplan?Meier 壽命表法行單因素生存分析繪制生存曲線、COX 比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BTLA、LAG3 和TIM3 在卵巢組織中的表達(dá) 正常卵巢組織、良性、交界性上皮卵巢腫瘤及上皮性卵巢癌中BTLA 的陽(yáng)性率分別為0%、31.6%、50%、91.25%；LAG3 的陽(yáng)性率分別為16.7%、34.2%、83.3%、87.5%；TIM3 的陽(yáng)性率分別為10%、47.4%、83.3%、95%。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈上升趨勢(shì)（P＜0.001）。見(jiàn)圖1～3。

圖2 LAG3 在不同組織中表達(dá)（IHC×400） Fig.2 Expression of LAG3 in different tissues

圖3 TIM3 在不同組織中表達(dá) Fig.3 Expression of TIM3 in

2.2 BTLA、LAG3 和TIM3 與卵巢癌臨床病理因素的差異分析 早期（Ⅰ/Ⅱ期）上皮性卵巢癌BTLA、LAG3 和TIM3 的表達(dá)陽(yáng)性率低于晚期（Ⅲ/Ⅳ期），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004、0.01 及0.023），表明期別越晚，陽(yáng)性表達(dá)率越高。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，BTLA、LAG3 和TIM3 的陽(yáng)性表達(dá)率越高（P=0.016、0.036 及0.002）。LAG3 表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，分級(jí)越高，分化程度越低，陽(yáng)性表達(dá)率越高（P=0.017），而B(niǎo)TLA 及TIM3 與組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性（P=0.786 及0.126）。BTLA、LAG3、TIM3 與年齡（P=0.759、0.383 及0.596）、組織學(xué)類型（P=0.809、0.052 及0.165）及腹腔轉(zhuǎn)移（P=0.553、0.091 及0.124）無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.5）。

2.3 BTLA、LAG3和TIM3的表達(dá)與卵巢癌患者的生存分析 應(yīng)用Kaplan?Meier 法壽命表法，BTLA陰性表達(dá)的患者生存曲線明顯高于陽(yáng)性表達(dá)組，BTLA 表達(dá)（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存時(shí)間為51.1、29.4、30.0、28.2 個(gè)月，整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），兩兩比較發(fā)現(xiàn)陰性與陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015、0.002、0.001），不同程度陽(yáng)性表達(dá)間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084、0.758、0.793），預(yù)后差。LAG3 表達(dá)（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存時(shí)間為49.1、31.0、29.8、25.6 個(gè)月，整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較發(fā)現(xiàn)陰性與陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016、0.002、0.000），不同程度陽(yáng)性表達(dá)間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.521、0.116、0.189），預(yù)后差。TIM3 表達(dá)（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存時(shí)間為56.4、34.2、31.7、28.4 個(gè)月，整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），兩兩比較發(fā)現(xiàn)陰性與陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023、0.008、0.001），不同程度陽(yáng)性表達(dá)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.367、0.130、0.377），預(yù)后差。見(jiàn)圖4。

圖4 BTLA，LAG3 及TIM3 表達(dá)與卵巢癌患者的生存分析Fig.4 Survival Analysis Of Patients Whose BTLA，LAG3 And TIM3 Positive Expression

2.4 BTLA、LAG3 和TIM3 的表達(dá)與卵巢癌患者的Cox單因素及多因素生存回歸分析 單因素生存分析提示，生存時(shí)間與FIGO分期（P＜0.01）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01）、LAG3（P＜0.01）、TIM3（P＜0.01）、BTLA（P=0.004）蛋白的陽(yáng)性表達(dá)有關(guān)（P＜0.05）。而與年齡（P=0.75）、組織學(xué)分級(jí)（P=0.951）、組織學(xué)類型（P=0.77）、有無(wú)腹水（P=0.13）無(wú)關(guān)。將BTLA、LAG3、TIM3 分別納入FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Cox 多因素生存分析回歸模型，提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BTLA、LAG3、TIM3為累積生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.01）。BTLA、LAG3、TIM3 陰性表達(dá)的患者相對(duì)危險(xiǎn)度比陽(yáng)性表達(dá)的患者低，且隨陽(yáng)性表達(dá)率的升高，相對(duì)危險(xiǎn)度升高，預(yù)后變差（P＜0.01）。

3 討論

上皮性卵巢癌是目前病死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，往往因?yàn)槿狈τ行У脑缙谠\斷方法，多于晚期發(fā)現(xiàn)，且無(wú)有效的治療方法，大大降低患者生存率及生存時(shí)間。當(dāng)前，針對(duì)上皮性卵巢癌的治療，多以手術(shù)為主，化療為輔，而免疫抑制劑的使用為許多惡性腫瘤的治療帶來(lái)了福音。

BTLA 屬于CD28 家族新成員［11］，在活化T 細(xì)胞尤其是Th1 細(xì)胞高表達(dá)［4］，與其配體皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)（HVEM）相互作用時(shí)產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，負(fù)性調(diào)控淋巴細(xì)胞，抑制T 細(xì)胞活化，起到抗腫瘤作用［12］。目前的研究是首次使用免疫組化方法在卵巢癌組織中檢測(cè)BTLA，正常組織中無(wú)明顯BTLA陽(yáng)性表達(dá)，在上皮性卵巢癌組織中BTLA 表達(dá)情況高于良性上皮性卵巢腫瘤，同樣高于交界性上皮性卵巢腫瘤，證實(shí)BTLA 表達(dá)與卵巢癌相關(guān)，且隨上皮性卵巢癌FIGO 分期增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍擴(kuò)大，其陽(yáng)性表達(dá)率越高，預(yù)后越差。從單因素和多因素分析顯示，BTLA 作為卵巢癌患者獨(dú)立預(yù)后因素具有重要指向性作用，推測(cè)BTLA 過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致較差的預(yù)后，因?yàn)門 細(xì)胞活化的下調(diào)程度較大，可通過(guò)檢測(cè)BTLA 表達(dá)情況推測(cè)患者預(yù)后，阻斷BTLA 途徑可能是治療卵巢癌的新方法。

LAG?3 為免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，與配體MHC?II 類分子結(jié)合能夠抑制T 細(xì)胞的成熟、分化及增殖，造成癌細(xì)胞免疫逃逸［13］，LAG3 高表達(dá)于Th1 細(xì)胞，通過(guò)抗LAG3 抗體阻斷LAG?3 可以恢復(fù)Th1 細(xì)胞功能，增強(qiáng)腫瘤壞死因子IFN?γ 的分泌及其細(xì)胞毒性作用［14］。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)LAG3 在女性惡性腫瘤上皮性卵巢癌還尚未有研究報(bào)導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用免疫組化法證實(shí)80 例上皮性卵巢癌組織中的LAG3 分子的表達(dá)情況，表達(dá)率高于正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤及交界性上皮性卵巢腫瘤。惡性卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為87.5（70/80），其中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)者為47.5（38/80），與PARRA 等［7］在肺癌中的研究結(jié)果一致。本次研究結(jié)果，LAG3 的表達(dá)水平與上皮性卵巢癌的分期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。臨床病理分期越晚，病理分級(jí)越高，分化越低及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移者，其陽(yáng)性表達(dá)率越高，生存率越低，提示其可能作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，LAG3 高表達(dá)減弱腫瘤免疫及抑制作用，參與卵巢癌的發(fā)生，并與惡性程度相關(guān)。

TIM3 為KUCHROO 等［15］發(fā)現(xiàn)的新型基因家族成員，與半乳糖凝集素-9 相互作用可導(dǎo)致Th1細(xì)胞和Tc1 細(xì)胞凋亡［16］，抑制T 細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖，減弱其分泌細(xì)胞因子能力及增殖能力［17］，TIM3 失活，T 細(xì)胞抗腫瘤作用也增強(qiáng)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，TIM3 表達(dá)在正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤及上皮性卵巢癌中表達(dá)遞增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TIM3 在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)，且隨FIGO 分期的期別增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍擴(kuò)大，其陽(yáng)性表達(dá)程度遞增，平均生存時(shí)間縮短，預(yù)后較差。依據(jù)單因素及多因素分析，TIM3 可作為判斷卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，通過(guò)檢測(cè)TIM3 可作為卵巢癌早期診斷的相對(duì)可靠指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，BTLA、LAG3、TIM3 的陽(yáng)性表達(dá)情況與上皮性卵巢癌的生存時(shí)間呈負(fù)性相關(guān)，且根據(jù)多因素相關(guān)分析，得出BTLA、LAG3、TIM3 為影響卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，據(jù)此推測(cè)，檢測(cè)BTLA、LAG3、TIM3 可作為判斷上皮性卵巢癌患者預(yù)后的特異性腫瘤因子，有益于上皮性卵巢癌的早期篩查及早期診斷。BTLA、LAG3、TIM3 作為免疫檢測(cè)靶點(diǎn)已證實(shí)在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)，其參與T 細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)控，抑制BTLA、LAG3、TIM3 的活性，可以增強(qiáng)T 細(xì)胞抗腫瘤作用，阻斷BTLA、LAG3、TIM3 途徑可作為新的免疫抑制治療，大大提高患者生存率。本研究樣不足之處在于樣本量較小，其在卵巢癌中的意義及作用仍需加大樣本進(jìn)一步研究。