二氟甲基鳥氨酸對(duì)2型糖尿病大鼠心肌肥厚及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

林 巖，王 珺，肖 薇，李 波，金 莉，廉 潔，于 水

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院1.病理生理學(xué)教研室、2.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006 )

糖尿病心肌病(diabetic cardiomypathy，DCM)為2型糖尿病(type 2 diabetic melitus，T2DM)患者常見的心臟并發(fā)癥，主要病理表現(xiàn)為微血管病變導(dǎo)致的心肌肥大、局灶性心肌壞死、心肌纖維化，易并發(fā)心力衰竭及心律失常，是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1-2]。近年來發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者高血糖狀態(tài)、心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，均可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，ERS在DCM發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。

多胺包括腐胺、精脒和精胺，是廣泛存在于生物體各種組織細(xì)胞內(nèi)的小分子脂肪族化合物。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成途徑中的關(guān)鍵限速酶。二氟甲基鳥氨酸(DL-α-difluoromethylornithine，DFMO)同鳥氨酸的結(jié)構(gòu)類似，被公認(rèn)為最有效的ODC特異性抑制劑，可作為ODC的底物進(jìn)行脫羧反應(yīng)，導(dǎo)致ODC發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)改變，降低細(xì)胞內(nèi)多胺含量[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，DFMO通過抑制ERS，具有抑制心肌肥大及心肌細(xì)胞凋亡的作用[5-6]，但是其對(duì)T2DM引發(fā)的心肌肥厚及ERS的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以T2DM大鼠為研究對(duì)象，探討DFMO對(duì)T2DM大鼠心肌肥厚的影響，并從ERS角度探討其機(jī)制。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，♂，SPF級(jí)，體質(zhì)量(200～250) g。由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物合格證編號(hào):SYXK( 黑) 2008004。

1.2藥物與試劑高糖高脂飼料(20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇、1%膽鹽和66.5%基礎(chǔ)飼料)，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供；鏈脲佐菌素(steptozotocin，STZ)、DFMO，均購自美國Sigma公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測(cè)定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器光學(xué)顯微鏡、病理切片機(jī)(德國徠卡公司)；離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；血糖儀(美國強(qiáng)生公司)；電泳儀、電泳槽(上海天能科技有限公司)電泳成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，12 h晝夜交替人工照明。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、模型組40只。對(duì)照組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)，模型組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，4周后禁食不禁水，一次性腹腔注射STZ 55 mg·kg-1(溶于0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液中，pH 4.4，冰浴，現(xiàn)配現(xiàn)用，5 min內(nèi)用完)，72 h后尾靜脈采血測(cè)量血糖濃度，血糖≥16.7 mmol·L-1為T2DM大鼠造模成功，正常對(duì)照組大鼠單次腹腔注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液。將成模的T2DM大鼠隨機(jī)分為2組，模型組12只、治療組14只，治療組進(jìn)行DFMO干預(yù)，T2DM大鼠給予2% DFMO水溶液連續(xù)飲用12周。實(shí)驗(yàn)過程中，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均給予高糖高脂飼料。

2.2取材干預(yù)治療12周后，大鼠禁食10 h，取大鼠尾靜脈血測(cè)定血糖。處死前，稱量大鼠體質(zhì)量(body weight, BW)，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，迅速開胸取出心臟，剪去心臟周圍組織和血管，濾紙吸干后，稱全心重(heart weight, HW)，沿室間隔剪去右心室組織，稱量左室重(left ventricular weight，LVW)。計(jì)算心臟參數(shù)HW/BW和LVW/BW。4%多聚甲醛固定心肌組織，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)的變化，將心肌組織置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3生化指標(biāo)檢測(cè)各組大鼠取左心室組織，勻漿后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，分別測(cè)定MDA含量、SOD和T-AOC活性。

2.4Masson染色石蠟切片脫蠟至水，自來水和蒸餾水沖洗，蘇木精染液染核5～10 min，充分水洗后，用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色5～10 min，浸洗分化后，苯胺藍(lán)液染5 min，二甲苯透明、中性樹膠封固。膠原纖維被苯胺藍(lán)所染呈藍(lán)色，肌纖維被麗春紅所染呈紅色。

2.5Westernblot檢測(cè)各組取心肌組織約50 mg，裂解液充分作用，4 ℃離心后取上清液，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，蛋白定量，蛋白變性。各組蛋白上樣量為30 μg，SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h后，分別加入一抗GRP78、CHOP、β-actin(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1.5 h。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，電泳成像系統(tǒng)定量掃描分析，結(jié)果以β-actin校正。

3 結(jié)果

3.1DFMO對(duì)T2DM大鼠空腹血糖和心臟參數(shù)的影響心臟參數(shù)HW/BW和LVW/BW能夠反映大鼠的心肌肥厚程度。Tab 1結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，T2DM組大鼠空腹血糖及心臟參數(shù)HW/BW、LVW/BW均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，治療組大鼠空腹血糖和心臟參數(shù)HW/BW、LVW/BW均低于糖尿病組(P<0.05)。

Tab 1 Effect of DFMO on blood glucose and index of cardiac hypertrophy in type 2 diabetic

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsT2DM

3.2DFMO對(duì)MDA、SOD和T-AOC的影響Tab 2結(jié)果顯示，T2DM模型組大鼠與對(duì)照組比較，心肌組織MDA含量明顯增高(P<0.01)，SOD活性和T-AOC明顯下降(P<0.01)；與T2DM模型組比較，DFMO治療組MDA含量明顯下降(P<0.01)，SOD和T-AOC活性升高(P<0.05，P<0.01) 。

Tab 2 Effect of DFMO on content of MDA, activities of SOD and T-AOC of myocardial tissues in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM

3.3DFMO對(duì)心肌間質(zhì)纖維化的影響Masson染色是經(jīng)典膠原纖維染色方法，染色后膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。Fig 1結(jié)果表明，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞間隙清晰可見，間質(zhì)膠原纖維極少。與對(duì)照組相比，T2DM組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管旁有較多明顯藍(lán)色深染；治療組與T2DM組比較，心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管旁的藍(lán)色深染逐漸減少，膠原沉積逐漸減輕，表明DFMO可以一定程度抑制T2DM大鼠心肌膠原纖維的沉積。

3.4DFMO對(duì)心肌組織GRP78和CHOP蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，T2DM組與對(duì)照組比較，GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；DFMO治療組與T2DM組比較，GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。

4 討論

DCM是由高血糖、心肌代謝紊亂引起的心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷，是T2DM患者常見并發(fā)癥，典型表現(xiàn)為心臟微血管病變及心肌纖維化，最終引發(fā)左心室肥厚，心肌功能障礙及心力衰竭。DCM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激、炎癥、心肌細(xì)胞凋亡、糖脂代謝紊亂、線粒體損傷、心肌纖維化，都被認(rèn)為是DCM發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制[7-8]，目前臨床對(duì)DCM尚缺乏有效的治療措施。

Fig 1 Masson staining of myocardium in rats(×400)

Fig 2 Effect of DFMO on protein expression of GRP78 and

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsT2DM group

多胺生理作用廣泛，能與細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，從而影響和調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能。DFMO為多胺合成代謝限速酶的特異性抑制劑，通過抑制鳥氨酸脫羧酶活性，明顯降低細(xì)胞內(nèi)多胺水平，從而減弱胃腸道組織、心肌組織等增生反應(yīng)。前期研究表明，DFMO通過抑制鳥氨酸脫羧酶活性，減少細(xì)胞內(nèi)多胺含量，對(duì)老年性心肌病、心肌肥厚、心肌缺血/再灌注損傷等具有保護(hù)作用，但對(duì)糖尿病引起的心肌肥大尚無明確報(bào)道。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，DFMO能夠明顯降低T2DM大鼠空腹血糖和心臟參數(shù)，改善T2DM大鼠的心肌肥厚。

高糖血癥和胰島素抵抗是T2DM的主要特征，二者均使葡萄糖和脂肪酸的氧化作用增加，而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，線粒體內(nèi)部活性氧大量聚集，進(jìn)一步加重T2DM患者的代謝紊亂，導(dǎo)致惡性循環(huán)[9]。生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DFMO干預(yù)后，心肌組織MDA含量明顯降低，SOD活性和T-AOC明顯升高，提示DFMO可通過抑制心肌脂質(zhì)過氧化物生成，增強(qiáng)總抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而對(duì)T2DM發(fā)揮保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激、缺氧、脂質(zhì)積聚等病理刺激都會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集，從而引發(fā)ERS[10]。ERS通過上調(diào)GRP78的表達(dá)，有助于蛋白質(zhì)折疊修復(fù)，但若ERS長時(shí)間持續(xù)，通過促進(jìn)CHOP的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程[11-12]。本研究中，T2DM大鼠心肌組織GRP78和CHOP表達(dá)水平增加，DFMO治療組GRP78和CHOP蛋白表達(dá)水平降低，提示ERS參與了T2DM的發(fā)生、發(fā)展，表明DFMO對(duì)T2DM的心肌保護(hù)作用與ERS具有相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，DFMO可降低大鼠心肌組織GRP78和CHOP蛋白表達(dá)，該結(jié)果可能與其心肌保護(hù)作用有關(guān)。

(致謝：感謝齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究室為本課題研究提供儀器設(shè)備和技術(shù)支持。)