經(jīng)白色念珠菌脅迫后家蠅新型抗菌肽AMP17表達(dá)模式的研究①

馬慧玲 李 妍 蘇佩佩 趙欣宇 楊隆兵 陶如玉 國(guó) 果

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025)

昆蟲(chóng)抗菌肽是機(jī)體先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，當(dāng)機(jī)體受到感染性損傷或免疫刺激后，蟲(chóng)體可以產(chǎn)生抗菌肽，以抵御病原體入侵，這些抗菌肽對(duì)多種病原物如細(xì)菌、真菌、病毒及病原蟲(chóng)均有殺傷作用，且作用機(jī)制獨(dú)特，不會(huì)損傷和破壞高等動(dòng)物的正常細(xì)胞[1-6]。自從七十年代中期瑞典科學(xué)家Boman[7]發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)抗菌肽Cecropins以來(lái)，昆蟲(chóng)抗菌肽已成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。

病原真菌是昆蟲(chóng)病原微生物中最大的一類(lèi)，約有60%以上的昆蟲(chóng)疾病由病原真菌引起[8]。真菌細(xì)胞壁是昆蟲(chóng)識(shí)別真菌的靶位置，昆蟲(chóng)可通過(guò)對(duì)病原真菌細(xì)胞壁成分的識(shí)別實(shí)現(xiàn)免疫防御反應(yīng)。有研究顯示在果蠅、黃粉蟲(chóng)中，革蘭氏陰性菌識(shí)別蛋白-3(GNBP3)可識(shí)別真菌細(xì)胞壁成分β-1，3葡聚糖，激活免疫信號(hào)通路，參與機(jī)體先天免疫防御反應(yīng)[9-11]?？咕氖桥c昆蟲(chóng)體液免疫密切相關(guān)的小分子活性蛋白質(zhì)。Iijima等[12]從麻蠅(Sarcophaga peregrina)幼蟲(chóng)血淋巴分離出抗真菌肽AFP,該肽能夠抑制白色假絲酵母(Candida albicans)生長(zhǎng),并可以與真菌結(jié)合造成真菌細(xì)胞質(zhì)泄漏導(dǎo)致真菌死亡[12]。昆蟲(chóng)對(duì)外來(lái)微生物的抵御是多免疫因子和多免疫組織共同協(xié)作的過(guò)程。 呂丁丁等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同家蠶組織在感染白僵菌后，4種抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2 和 lysozyme相對(duì)表達(dá)水平隨時(shí)間的變化也不同，說(shuō)明不同組織對(duì)白僵菌有不同的防御機(jī)制。正常情況下，昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)抗菌肽的表達(dá)水平不是很高， 但可以被微生物誘導(dǎo)表達(dá)。黃玉霞等[14]發(fā)現(xiàn)家蠶感染白僵菌后,可能誘導(dǎo)激活Toll信號(hào)通路，從而調(diào)控 enbocin1 基因上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。楊雪等[15]研究發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽muscin 基因在血細(xì)胞和脂肪體中表達(dá)量最高，通過(guò)細(xì)菌刺激進(jìn)行免疫誘導(dǎo)后，幼蟲(chóng)體內(nèi)該基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，并在 6 h 達(dá)到高峰，推測(cè)該基因參與家蠅抗菌免疫反應(yīng)。

家蠅(Musca domestica)屬于世界性分布的昆蟲(chóng)，是一種衛(wèi)生害蟲(chóng)又是一種重要的資源昆蟲(chóng)，大量研究表明其擁有強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)[16-18]。AMP17是本課題組在前期研究中，從微生物誘導(dǎo)的家蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組中篩選到一條特異性高表達(dá)的基因[19，20]。我們采用原核表達(dá)系統(tǒng)，克隆表達(dá)并純化得到了重組MD-AMPs-17蛋白，該重組蛋白在體外顯示了較強(qiáng)的抗真菌活性[21]。為了進(jìn)一步了解該基因在家蠅免疫防御反應(yīng)中的作用，本研究探討了經(jīng)白色念珠菌脅迫后，AMP17的時(shí)空表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示該蛋白的功能及家蠅抗真菌機(jī)制奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物材料與菌種 實(shí)驗(yàn)家蠅由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度28℃，相對(duì)濕度65%，光照周期10L：14D，3齡幼蟲(chóng)均重26.5 mg。白色念珠菌(ATCC10231)為貴州醫(yī)科大學(xué)微生物教研室王濤博士惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑和儀器 Trizol、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、焦碳酸二乙酯(DEPC)、RNA保護(hù)劑(均購(gòu)自大連寶生物TaKaRa公司)；去RNA酶EP管、PCR耗材(美國(guó)Sigma公司)；異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)及濾紙均購(gòu)自貴州索萊寶貿(mào)易有限公司。

ABI7300熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)、PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)、顯微解剖鏡(尼康)、顯微超微量注射儀(美國(guó))、Milli-Q超純水儀(法國(guó)Millipore Pharmacia公司)、Allegra 64R 冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本制備 將白色念珠菌在沙氏固體培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種2次，之后挑取單克隆接種于沙氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，用無(wú)菌PBS緩沖液將菌液稀釋至1.0×108cfu/ml。以白色念珠菌作為感染源，通過(guò)顯微超微量注射儀注射家蠅第2天幼蟲(chóng)，注射濃度為：1.0×108cfu/ml，注射體積210 nl，設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組，注射等體積PBS緩沖液為對(duì)照組。分別收集顯微注射3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后的整蟲(chóng)標(biāo)本以及受脅迫后3 h、12 h、48 h 家蠅幼蟲(chóng)不同組織(體壁、脂肪體、馬氏管、中腸、唾液腺、氣管、血淋巴)標(biāo)本。

1.2.2家蠅幼蟲(chóng)組織標(biāo)本解剖 選取受脅迫后3 h、12 h、48 h家蠅幼蟲(chóng),浸泡在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，剪頭法收集血淋巴，用小剪刀自蟲(chóng)體末端沿體壁剪一個(gè)小口可見(jiàn)體液溢出，然后小心翼翼沿傷口處剪向頭端。在顯微解剖鏡下用鑷子撥開(kāi)體壁，分離脂肪體、中腸、馬氏管、唾液腺、氣管。

1.2.3總RNA的提取及cDNA合成 對(duì)所收集的標(biāo)本，按照Trizol法提取總RNA，檢測(cè)其濃度和純度后，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)分別合成cDNA，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4引物的設(shè)計(jì)與合成 以RPS18為內(nèi)參基因，根據(jù)RPS18及AMP17基因的cDNA序列運(yùn)用primer5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。引物由TaKaRa公司合成,其序列如下：AMP17-F：5′-TGGGATGTGTTGGTTCCGATT-3′；AMP17-R：5′-CGCTACTTCAATGGAACTGGT-3′。RPS18-F：5′-AAGGGTGTGG-GTCGCCGTT-3′；RPS18-R：5′-GCAATGGGTTGGAGA-TGAT-3′。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取上述家蠅幼蟲(chóng)感染后不同時(shí)間點(diǎn)(3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h)及感染后3 h、12 h、48 h的家蠅幼蟲(chóng)不同組織(體壁、馬氏管、脂肪體、腸、唾液腺、血淋巴、氣管)的cDNA(1∶10稀釋)為模板，RPS18為內(nèi)參基因，按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明，使用ABI PRISM7300(ABI，USA)進(jìn)行real-time PCR，每個(gè)樣品重復(fù)3次，每組3個(gè)重復(fù)。 反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl；上游引物 0.8 μl；下游引物 0.8 μl；ROX Reference DyeⅠ(50×)0.4 μl；cDNA 1.0 μl；ddH2O 7.0 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s，58℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCT方法計(jì)算并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS15.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用Graphpad Prism 5繪圖。

2 結(jié)果

2.1AMP17基因在顯微注射感染白色念珠菌的家蠅幼蟲(chóng)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況 經(jīng)白色念珠菌脅迫后， 實(shí)驗(yàn)組幼蟲(chóng)的AMP17基因表達(dá)量較對(duì)照組明顯上調(diào)，在48 h該基因表達(dá)量達(dá)到最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其次是3 h、6 h、12 h，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在感染后24 h和36 h，該基因的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。 總體上家蠅AMP17基因的表達(dá)量隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低再升高的狀態(tài)(圖1)。

2.2AMP17基因在顯微注射感染白色念珠菌不同時(shí)間點(diǎn)的家蠅幼蟲(chóng)不同組織的表達(dá)情況 根據(jù)家蠅感染白色念珠菌后不同時(shí)間點(diǎn)AMP17基因的表達(dá)情況，選取經(jīng)脅迫后3 h、12 h、48 h的幼蟲(chóng)，顯微解剖鏡下分離各組織(圖2)，分析家蠅AMP17基因在各組織(體壁、脂肪體、馬氏管、中腸、唾液腺、氣管、血淋巴)的表達(dá)量。在3 h時(shí)，以PBS組為對(duì)照進(jìn)行計(jì)算，體壁表達(dá)量最高，上調(diào)了6.59倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其次為氣管，上調(diào)了4.74倍；血淋巴和脂肪體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)(圖3A)。在12 h時(shí)，以PBS為對(duì)照組進(jìn)行計(jì)算，體壁表達(dá)量最高，上調(diào)了5.54倍(P<0.01)，其次為血淋巴，上調(diào)了1.87倍(P<0.05)；氣管、脂肪及唾液腺呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)(圖3B)。在48 h時(shí)，以PBS為對(duì)照組進(jìn)行計(jì)算，體壁表達(dá)量最高，上調(diào)了10.98倍(P<0.05)；其次為唾液腺，上調(diào)了7.28倍(P<0.05)。血淋巴、中腸及馬氏管呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)(圖3C)。

圖1 AMP17經(jīng)顯微注射白色念珠菌誘導(dǎo)后家蠅幼蟲(chóng)中的表達(dá)差異Fig.1 Variation in expression of AMP17 gene in Musca domestica larvae after microinjected Candida albicans

圖2 家蠅幼蟲(chóng)不同組織標(biāo)本Fig.2 Different tissue specimens from Musca domestica arvae

圖3 AMP17經(jīng)白色念珠菌誘導(dǎo)后家蠅幼蟲(chóng)中不同組織的表達(dá)差異Fig.3 Variation in expression of AMP17 gene in Musca domestica larvae after Candida albicans induction

3 討論

基因表達(dá)是指基因指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)合成過(guò)程，是調(diào)控生命活動(dòng)的重要機(jī)制，不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下基因的表達(dá)決定了整個(gè)生命過(guò)程包括發(fā)育和分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、對(duì)逆環(huán)境的反應(yīng)等，因此比較不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下的基因表達(dá)情況可為分析不同生命活動(dòng)過(guò)程提供重要信息[22]。當(dāng)受到病原體或環(huán)境因素脅迫時(shí)，昆蟲(chóng)機(jī)體會(huì)做出快速有效的免疫應(yīng)答?？咕氖抢ハx(chóng)體液免疫的重要效應(yīng)分子，在受到感染和損傷時(shí)，昆蟲(chóng)的抗菌肽能夠迅速合成,在信號(hào)肽酶的作用下成為有活性的物質(zhì)，參與機(jī)體免疫應(yīng)答[23]。

本研究中，經(jīng)白色念珠菌脅迫后，AMP17基因的表達(dá)量隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低再升高的狀態(tài)。可能在反應(yīng)初期,AMP17基因的表達(dá)量應(yīng)激性增高， 抗菌肽迅速合成，作為主要效應(yīng)分子參與免疫應(yīng)答,抵御損傷和病原體；之后，可能由于其他防御物質(zhì)表達(dá)增加，或一些抑制因子的表達(dá)，使得機(jī)體對(duì)AMP17的需求減少以維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，以至在誘導(dǎo)后 24～36 h 有一個(gè)降低的過(guò)程[24];隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，存活的白色念珠菌數(shù)量不斷增長(zhǎng)，48 h AMP17出現(xiàn)上調(diào)最高峰，可能是由于機(jī)體被大量真菌攻擊后，激活了體內(nèi)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多抗菌肽以應(yīng)對(duì)病原體的侵害，提示AMP17基因參與了家蠅先天免疫的后期調(diào)節(jié)[25]。昆蟲(chóng)對(duì)外來(lái)微生物的抵御是多免疫因子和多免疫組織共同協(xié)作的過(guò)程[26，27]。本研究還發(fā)現(xiàn)受到白色念珠菌脅迫后，AMP17 基因在不同家蠅組織相對(duì)表達(dá)水平隨時(shí)間的變化也有不同，說(shuō)明不同組織對(duì)白色念珠菌有不同的防御機(jī)制。體壁是昆蟲(chóng)直接接觸外界環(huán)境的重要組織，是保護(hù)機(jī)體免受外界各種刺激和損傷的第一道防線，它不僅是機(jī)體的物理屏障，同時(shí)也作為免疫器官發(fā)揮作用，相關(guān)研究指出，當(dāng)機(jī)體受到微生物侵染時(shí)，昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的體壁能夠啟動(dòng)免疫應(yīng)答應(yīng)對(duì)挑戰(zhàn)[28，29]。顯微注射白色念珠菌3 h、12 h、48 h后，體壁呈現(xiàn)高表達(dá)，推測(cè)是針刺感染的過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)，體壁損傷后，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的免疫相關(guān)因子，從而達(dá)到防御外源病原體的入侵并修復(fù)損傷的目的[30]。血淋巴及脂肪體為昆蟲(chóng)的主要免疫器官，參與昆蟲(chóng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[31，32]。本次研究中，血淋巴、脂肪體及唾液腺在白色念珠菌誘導(dǎo)后，表達(dá)水平相對(duì)較低，但將誘導(dǎo)12 h較3 h的相對(duì)表達(dá)水平相比較，都有上升趨勢(shì)，且脂肪體及唾液腺在誘導(dǎo)48 h時(shí)達(dá)到高峰，與不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)結(jié)果相符。

綜上所述，AMP17基因參與了家蠅免疫應(yīng)答反應(yīng)，是家蠅免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子之一，在家蠅先天免疫中扮演著重要的角色。本研究結(jié)果有利于深入理解家蠅乃至其他昆蟲(chóng)抵御真菌侵染的防御機(jī)制，為進(jìn)一步探討家蠅先天免疫系統(tǒng)提供新的思路。