戈寶紅麻葉片水提物的抗氧化作用

張孟麗， 張衛(wèi)明， 束成杰*

( 1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211100)

戈寶紅麻(ApocynumvenetumL.var.aletaienseH.T.Lau，var.nov.)為多年生草本植物，宿根正?？纱婊?0 a左右，根系發(fā)達(dá)，具有極強(qiáng)的抗逆性，是美化沙漠、防風(fēng)固沙、涵養(yǎng)水源、改善局域環(huán)境最好的生態(tài)植物[1]。戈寶紅麻含有黃酮類、糅質(zhì)、甾體類、有機(jī)酸類、氨基酸等活性成分，其具有解郁安神、降血壓、降血脂、抗氧化等功效[2-3]。

機(jī)體氧化衰老在自然界是不可逆的，其機(jī)制復(fù)雜。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，逐漸認(rèn)識(shí)到化學(xué)合成抗氧化劑的危害，天然抗氧化劑由于具有天然、高效、低毒的特點(diǎn)逐漸為人們所利用并取代人工合成抗氧化劑。天然抗氧化劑是直接從天然生物中提取的抗氧化劑，對(duì)人的副作用和傷害較小，因此國內(nèi)外對(duì)天然抗氧化物質(zhì)的研究越來越多[4]。秀麗隱桿線蟲作為經(jīng)典模式生物，由于自身結(jié)構(gòu)簡單，易于培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于人類遺傳學(xué)疾病、藥物篩選、衰老與壽命、信號(hào)傳導(dǎo)等各個(gè)領(lǐng)域[5-6]。筆者通過體外研究戈寶紅麻葉片水提物的抗氧化活性，借助秀麗隱桿線蟲通過體內(nèi)研究其抗衰老作用，以期為戈寶紅麻葉片的高值高效利用，開發(fā)抗氧化、降低血糖血脂等功能性食品及保健品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 戈寶紅麻葉片、線蟲與菌株 戈寶紅麻葉片為成熟期戈寶紅麻葉片，采自新疆阿勒泰地區(qū)；秀麗隱桿線蟲為野生型N2，大腸桿菌菌株E.coliOP50(尿嘧啶缺陷型)，均由南京野生植物綜合利用研究院提供。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海麥克林公司)，瓊脂、多聚蛋白胨(日本制藥株式會(huì)社),超氧化物歧化酶測(cè)試盒、過氧化氫酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器：電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司),T6紫外/可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠),奧林巴斯顯微鏡(OlympusBX41，南京艾朗儀器有限公司),渦旋震蕩器(上海珂淮儀器有限公司),SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),BG-50隔水式培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),JW-25017HR高速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司),JSZ6系列連續(xù)變倍體視顯微鏡(江南永新光學(xué)有限公司),紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司),酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品液制備 將戈寶紅麻葉片除雜干燥，粉碎，稱取粉末50 g，共2份，加入8倍體積水，80℃回流提取3次，每次1 h，合并提取液，5 000 r/min離心10 min，過濾放至室溫，減壓回收溶劑，收集濾液；分別將戈寶紅麻水提液置于真空冷凍干燥箱中干燥，得葉片水提物固體粉末，復(fù)溶。

1.2.2 體外抗氧化試驗(yàn)

1) 清除DPPH自由基。將戈寶紅麻水提物配置成1 mg/mL起始濃度備用。再將樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)維生素C(VC)依次配置成濃度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL和1 000 μg/mL的溶液，標(biāo)準(zhǔn)VC作陽性對(duì)照。用70%乙醇溶液配置成0.1 mmol/L DPPH溶液500 mL，放置于4℃冰箱保存。依次向10 mL試管中加入DPPH溶液4.0 mL、提取物0.2 mL，混勻后置于暗處放置30 min，測(cè)吸光度值A(chǔ)1；同時(shí)用70%乙醇代替DPPH溶液4.0 mL為樣品空白，測(cè)吸光度值A(chǔ)2；用70%乙醇溶液0.2 mL代替抗氧化物作空白對(duì)照，測(cè)吸光度值A(chǔ)0，用蒸餾水做參比，在波長510 nm下比色，最后計(jì)算清除率[7-8]。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

2) 清除超氧自由基(O2-·)。將戈寶紅麻水提物配置成1 mg/mL起始濃度備用。再將樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)VC依次配置成濃度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)VC作陽性對(duì)照。分別取50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL于10 mL試管中，放入25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入提取液2.0 mL，再加入25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混合后在25℃水浴條件下反應(yīng)4 min，后立即加入2滴8 mmol/L HCl終止反映，同時(shí)設(shè)定空白組和樣品空白組，用蒸餾水做參比，在波長320 nm下比色，最后計(jì)算清除率[9]。

3) 還原能力。將戈寶紅麻水提物配置成1 mg/mL起始濃度備用。再將樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)VC依次配置成濃度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL的溶液，標(biāo)準(zhǔn)VC作陽性對(duì)照。分別取各溶液2.0 mL，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液 (pH 6.6) 2.0 mL，再加入1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，混合后在50℃水浴中反應(yīng)20 min。取出后在混合物中加入10%三氯乙酸2.0 mL，再分別從中取出2.0 mL混合物，加蒸餾水2.0 mL和0.1%三氯化鐵0.4 mL于試管中，用蒸餾水稀釋至20 mL，反應(yīng)10 min后于700 nm處測(cè)定吸光度值[10]。

1.2.3 基于秀麗隱桿線蟲的體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)

1) 秀麗隱桿線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)的配制。氯化鈉3 g，瓊脂粉17 g，多聚蛋白胨2.5 g，加入蒸餾水975 mL，高壓滅菌。加入1 mol/L氯化鈣1 mL，1 mol/L硫酸鎂1 mL，磷酸鉀緩沖液25 mL，待冷卻至50℃左右時(shí)加入5 mg/mL膽固醇1 mL，搖晃混勻后倒入紫外滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)[9]。

2) 秀麗隱桿線蟲同步化。當(dāng)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)出現(xiàn)大量蟲卵時(shí)，加入秀麗隱桿線蟲裂解液(10%次氯酸∶1 mol/L氫氧化鈉=1∶1)，離心，洗滌，放置涂有直徑1 cm大腸桿菌E.coliOP50的培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)48～60 h，得年輕成蟲[11]。

3) 秀麗隱桿線蟲暴露方法。將同步化后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到含有大腸桿菌E.coliOP50的新培養(yǎng)基中，對(duì)照組加入M9緩沖液，暴露組分別加入濃度為10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL和1 000 μg/mL戈寶紅麻葉片水提物，20℃處理24 h，然后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

4) 水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響。隨機(jī)挑取暴露后的秀麗隱桿線蟲至含有大腸桿菌E.coliOP50的培養(yǎng)基上，每組33條，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，3次重復(fù)，在20℃條件下培養(yǎng)。將秀麗隱桿線蟲從培養(yǎng)基上洗下當(dāng)天起計(jì)算存活天數(shù)，并每天記錄存活和死亡條數(shù)，持續(xù)至最后1條死亡為止，以鉑金絲碰觸秀麗隱桿線蟲仍然不動(dòng)即判定為死亡。根據(jù)線蟲生存、死亡的條數(shù)繪制曲線[12-13]。

5) 水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)的影響。隨機(jī)挑取暴露后的秀麗隱桿線蟲至含M9緩沖液的空白培養(yǎng)基上，觀察其頭部擺動(dòng)頻率。觀察前先讓秀麗隱桿線蟲自由擺動(dòng)恢復(fù)1 min，在顯微鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)的頭部擺動(dòng)次數(shù)，作為頭部擺動(dòng)頻率指標(biāo)，每組觀察15條，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，3次重復(fù)。1次頭部擺動(dòng)定義為其頭部擺動(dòng)方向改變，改變必須轉(zhuǎn)過其身體朝向方向[14]。

6) 水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的影響。隨機(jī)挑取15條暴露后的秀麗隱桿線蟲至涂有大腸桿菌E.coliOP50的培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，觀察其吞咽頻率，在奧林巴斯高倍顯微鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)秀麗隱桿線蟲的吞咽次數(shù)，作為吞咽頻率指標(biāo)，3次重復(fù)[14]。

7) 水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲排泄周期的影響。隨機(jī)挑取15條暴露后的秀麗隱桿線蟲至涂有大腸桿菌E.coliOP50的培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，將每條秀麗隱桿線蟲取出觀察，當(dāng)體壁肌肉伸縮排泄到下一次排泄的時(shí)間即為排泄周期，在奧林巴斯高倍顯微鏡下觀測(cè)，3次重復(fù)[15-16]。

8) 水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲3種抗氧化酶活力水平的影響。準(zhǔn)確稱取對(duì)照組與處理組秀麗隱桿線蟲全部組織質(zhì)量，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶10的比例，加入12倍體積生理鹽水，冰水浴條件下手動(dòng)勻漿，5 000 r/min離心5 min，取上清液待測(cè)；各組秀麗隱桿線蟲超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)活性的測(cè)定，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒說明書進(jìn)行[17-19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.M)表示，用Microsoft Excel軟件繪制柱形圖，用SPSS 12.0軟件進(jìn)行不同組別間方差分析(ANOVA)，壽命試驗(yàn)運(yùn)用2尾檢驗(yàn)中的兩樣本t-檢驗(yàn)(Minitab Ltd.，Coventry，UK)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化效果

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，因其結(jié)構(gòu)簡單，反應(yīng)體系容易控制，多被應(yīng)用于各種物質(zhì)提取物或純化合物抗氧化活性的評(píng)價(jià)和篩選[20]。O2-·是人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快從皮膚到內(nèi)部器官整個(gè)肌體的衰老過程，并可誘發(fā)皮膚病變、心血管疾病、癌癥等，嚴(yán)重危害人體健康，人體通過超氧化物歧化酶(SOD)將其轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧氣除去[21]。從圖1可知，戈寶紅麻葉片水提物對(duì)DPPH、O2-·均具有一定的清除效果，清除率與濃度呈正相關(guān)；對(duì)DPPH清除率達(dá)50%的濃度為1 000 μg/mL，相當(dāng)于80 μg/mL濃度下Vc 的清除率。

還原力也是清除自由基能力評(píng)價(jià)的一個(gè)指標(biāo)，依據(jù)產(chǎn)物生成量作為評(píng)價(jià)還原力的指標(biāo)，OD值越大表明還原力越強(qiáng)。還原能力較強(qiáng)的物質(zhì)，能夠提供更多的電子，其供應(yīng)的電子能夠參與自由基反應(yīng)將其變?yōu)榉€(wěn)定物質(zhì)[21-22]。戈寶紅麻葉片水提物具有較好的還原力，隨著劑量增加還原力逐漸增強(qiáng)(圖1)。

2.2 體內(nèi)抗氧化效果

從圖2可看出戈寶紅麻葉片水提物不同濃度對(duì)秀麗隱桿線蟲的壽命、頭部擺動(dòng)頻率、排泄周期和吞咽頻率和抗氧化酶活力的影響。

圖1 戈寶紅麻葉片水提物的還原力及對(duì)自由基的清除效果Fig.1 Reducing power and DPPH scavenging activity of aqueous extract from A. venetum leaves

注：與對(duì)照(CK)組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: * and ** indicate significance of difference at P<0.05 and P<0.01 level respectively.

2.2.1 壽命 壽命是秀麗隱桿線蟲經(jīng)藥物處理前后變化最直接的反映。與對(duì)照組相比，戈寶紅麻葉片水提物10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL和1 000 μg/mL能顯著延長秀麗隱桿線蟲的壽命和半數(shù)致死天數(shù)，且壽命與濃度呈劑量效應(yīng)。

2.2.2 頭部擺動(dòng)頻率 秀麗隱桿線蟲經(jīng)藥物處理后，其神經(jīng)系統(tǒng)等功能會(huì)發(fā)生改變，頭部擺動(dòng)作為秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為之一，可作為反映神經(jīng)系統(tǒng)基本功能的指標(biāo)。與對(duì)照組相比，戈寶紅麻葉片水提物不同濃度處理均能顯著提高秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率，且隨濃度增加呈先上升后下降趨勢(shì)，其中，以500 μg/mL處理秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率最高。表明，戈寶紅麻葉片水提物能降低秀麗隱桿線蟲的機(jī)體氧化，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能。

2.2.3 排泄周期 是評(píng)價(jià)秀麗隱桿線蟲抗氧化的重要指標(biāo)，生長狀態(tài)越好其代謝能力越強(qiáng)，排泄周期越短。與對(duì)照組相比，戈寶紅麻葉片水提物處理均能顯著縮短秀麗隱桿線蟲的排泄周期，其中以500 μg/mL處理的排泄周期最短。表明，500 μg/mL戈寶紅麻葉片水提物能較好地維持秀麗隱桿線蟲的代謝能力，提高機(jī)體抗氧化水平。

2.2.4 吞咽頻率 能反映秀麗隱桿線蟲的攝食能力，并且秀麗隱桿線蟲的壽命可以通過咽泵運(yùn)動(dòng)速率間接進(jìn)行評(píng)價(jià)[24]。與對(duì)照組相比，戈寶紅麻葉片水提物10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL處理均能增加秀麗隱桿線蟲的吞咽頻率，其中，100 μg/mL和500 μg/mL處理增加顯著；1 000 μg/mL處理的吞咽頻率顯著下降，與對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命影響相統(tǒng)一。

2.2.5 抗氧化酶活力 抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化水平起至關(guān)重要的作用，能清除超氧陰離子自由基保護(hù)機(jī)體免受損傷；CAT能有效清除各種活性氧基團(tuán)，從而防止這些基團(tuán)對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能催化還原型谷胱甘肽(GSH)變?yōu)檠趸虶SH，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害[24]?？寡趸富盍υ鰪?qiáng)，則抗氧化能力增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，戈寶紅麻葉片水提物10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL處理秀麗隱桿線蟲的SOD、CAT、GSH活力均逐漸增強(qiáng)，而1 000 μg/mL處理的活力低于500 μg/mL處理，可能是濃度過高導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲出現(xiàn)機(jī)體損傷，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，抗氧化能力減弱。

3 結(jié)論與討論

戈寶紅麻是羅布麻的一種，是我國傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥，其味甘性平，具有補(bǔ)中益氣、抗缺氧、耐疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種作用。通過抗氧化體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，戈寶紅麻葉片水提物對(duì)DPPH、O2-·自由基均具有一定的清除能力，且隨質(zhì)量濃度的升高清除效果增強(qiáng)；還原力與水提物濃度呈劑量效應(yīng)，其中，以500 μg/mL水提物清除自由基的效果最好，說明戈寶紅麻水提物在體外具有良好的抗氧化作用。

在體外研究基礎(chǔ)上，為了證明提取物及純物質(zhì)在實(shí)踐應(yīng)用上的價(jià)值，前人多采用小鼠進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)及系列指標(biāo)測(cè)試。隨著科技水平的不斷進(jìn)步，秀麗隱桿線蟲因其結(jié)構(gòu)簡單，易于飼養(yǎng)，作為一種模式生物已在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。因此，利用模式生物秀麗隱桿線蟲的壽命、抗氧化酶活力等體內(nèi)各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，戈寶紅麻葉片水提物能提高秀麗隱桿線蟲的抗氧化能力，10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL能極顯著增強(qiáng)其體內(nèi)GSH-Px和CAT的活力，顯著提高SOD的活力，其中以500 μg/mL處理的效果最好。田立等[25]研究發(fā)現(xiàn)，羅布麻體外具有良好的抗氧化能力及其適量多糖抑制小鼠機(jī)體過氧化物的產(chǎn)生。由此表明，戈寶紅麻葉片水提物良好的抗氧化活性可能與其水提物中多糖有很大關(guān)系。研究結(jié)果為戈寶紅麻天然保健品的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。